細胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養液中氨基蝶呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。

另一條途徑是應急途徑或補救途徑（“S途徑”），它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸，兩種酶缺一不可。因此，在HAT培養液中，未融合的效應B細胞和兩個效應B細胞融合的“D途徑”被氨基蝶呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養液中增殖的能力，一般10d左右會死亡。對于骨髓瘤細胞以及自身融合細胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶缺陷型（HGPRT）細胞，因此自身沒有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基蝶呤阻斷，所以在HAT培養液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤細胞與效應B細胞相互融合形成的雜交瘤細胞，既具有效應B細胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細胞在體外培養液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養液中選擇性存活下來，并不斷增殖。