懸浮培養指的是一種在受到不斷攪動或搖動的液體培養基里，培養單細胞及小細胞團的組織培養系統，下面一起來了解一下懸浮細胞培養的操作步驟與注意事項。

　　一、步驟

　　1. 將準備好的凍存細胞放入37℃水浴中解凍。

　　2. 用70%乙醇對頂端進行消毒，用吸管將細胞轉移到含有5mlwan全MEM-10培養基的25cm2組織培養瓶中，輕輕搖動培養瓶，使細胞均勻分布于培養瓶中，放入5%CO2加濕培養箱中37℃培養過夜。

　　3. 將培養基吸出，用0.5ml37℃的胰酶/EDTA覆蓋細胞，消化30~40s。

　　4. 加入10ml旋轉瓶wan全培養基-5，并將細胞轉移至50ml的離心管中。室溫1800g離心5min，棄上清。

　　5. 將細胞沉淀懸浮在5ml的旋轉瓶wan全培養基-5中，上下吹打，將細胞團打散。

　　6. 在100ml或200ml通氣旋轉瓶中加入50ml旋轉瓶wan全培養基-5，并將細胞懸液轉移到瓶中。

　　7. 取出1ml細胞懸液，用血細胞計數器進行細胞計數。加入適量的旋轉瓶wan全培養基-5，使細胞密度為（3~4）×105細胞/ml。將細胞放入無CO2培養箱，37℃旋轉培養。

　　8. 隨后的兩天讓細胞繼續生長，并且每天對細胞進行計數，加入適量的旋轉瓶wan全培養基-5以維持（3~4）×105細胞/ml的細胞密度。

　　9. 取1ml的細胞懸液，用血細胞計數器對細胞進行監測。

　　10. 當細胞密度達到（4~5）×105細胞/ml時，隔天或每天用培養基將細胞稀釋至1.5×105或2.5×105細胞/ml。

　　11. 分別將裝有50ml或100ml細胞懸液的100ml或200ml通氣旋轉瓶放入37℃無CO2培養箱旋轉培養。每天或隔天傳代。

　　二、注意事項

　　由于有些細胞是不能被養活的，所以需要高的初始密度。