為了能夠長(zhǎng)期的保存大腸桿菌菌種且不破壞其結(jié)構(gòu)，通常將含有足量細(xì)菌的液體培養(yǎng)基離心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80℃凍存。之所以選擇甘油是因?yàn)楦视图词乖诔蜏貎鼋Y(jié)的情況下其體積也不會(huì)產(chǎn)生劇烈變化，不會(huì)導(dǎo)致由于其冰凍后體積的改變而壓迫菌種導(dǎo)致菌種結(jié)構(gòu)的改變。等到需要的時(shí)候再將超低溫冷凍的菌體，融化并培養(yǎng)即可。由于此時(shí)僅僅需要將菌種培養(yǎng)至符合其種子液的數(shù)量要求而無(wú)需考慮培養(yǎng)產(chǎn)物以及繁殖速度等問(wèn)題，所以一般采用最基礎(chǔ)的LB培養(yǎng)基即可。

LB培養(yǎng)基配方：胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4

液體培養(yǎng)基：

胰化蛋白胨 10.0g

酵母粉 5.0g

氯化鈉 10.0g

水 1000ml

pH 7.4

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再加入1.5％－2.0％的瓊脂

物料處理：

物料通常采用燒杯進(jìn)行稱(chēng)量主要是為了后續(xù)溶解方便并且不易外撒。

牛肉膏可采用小燒杯進(jìn)行稱(chēng)量，稱(chēng)量后在進(jìn)行溶解，避免與其他混合導(dǎo)致溶解困難。

蛋白胨由于其極易受潮故稱(chēng)量時(shí)需快速。

以上稱(chēng)量完成后，在上述燒杯中加入適量水進(jìn)行加熱，并充分?jǐn)嚢琛４渲盟幤啡砍浞秩芙獾暮螅偌尤脒m量水補(bǔ)足所需水分。

若需配置固體培養(yǎng)基則將稱(chēng)好的瓊脂加入溶解液中并加熱溶解，帶加熱后再補(bǔ)足所需水分。

Ps：瓊脂溶解過(guò)程中注意不斷攪拌防止糊底或加熱過(guò)快導(dǎo)致溢出。

分裝滅菌：將上述步驟所得培養(yǎng)基按所需規(guī)格進(jìn)行分裝并進(jìn)行包裝，后放入高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌即可。滅菌完成后需將其至于烘干機(jī)內(nèi)烘干直至包裝的封口紙等干燥，即可進(jìn)行后續(xù)的制版等操作。平板培養(yǎng)基制備完成后需倒置防止冷卻水滴入培養(yǎng)基內(nèi)。

如有剩余培養(yǎng)基剩余可將其儲(chǔ)存于錐形瓶?jī)?nèi)進(jìn)行保存，帶須使用時(shí)再進(jìn)行微波爐加熱即可。

接種：

1.取制備大腸桿菌凍存液，管口用用酒精燈灼燒后方可打開(kāi)。

2.接種方法一、用滅菌槍頭蘸取凍存液在平板邊緣上劃?rùn)M條，每三道為一組，旋轉(zhuǎn)平皿一圈，最后中間劃之字；接種方法二：用移液槍吸取溶液于平板上，用酒精燈滅菌厚的涂抹棒劃十字，涂布平板。通常采用的方法為方法一。

3.具體操作步驟：

一、將培養(yǎng)皿底部用拇指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開(kāi)。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線(xiàn) 3～5條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線(xiàn)部分作第2次平行劃線(xiàn)，然后再用同樣方法，通過(guò)第二次平行劃線(xiàn)部分作第三次平行劃線(xiàn)和通過(guò)第三次平行劃線(xiàn)部分作第四次平行劃線(xiàn)。

二、將菌液用移液槍在酒精燈旁接入錐形瓶?jī)?nèi)。此方法通常為確定菌種型號(hào)以及特性的情況下用于菌種繁殖。

Ps：平板劃線(xiàn)時(shí)需注意將保持接種針與板面之間的角度為30°，且出第一次劃線(xiàn)外其余均需將接種針與酒精燈上灼燒，消滅接種針上的殘余菌種。

大腸桿菌培養(yǎng)：將接種完成的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱或恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，即可得到所需的大腸桿菌菌落或種子液。