免疫熒光的原理

免疫熒光（Immunofluorescence,IF）原理免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。

紫外光激發熒光物質放射熒光示意圖免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（SlidesorCoverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據成功經驗總結出許多有益的細節或小竅門，非常值得借鑒。

固定和通透步驟最重要的是根據所研究抗原的性質選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步驟是類似的，最重要的區別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響。 用于免疫熒光染色的染料需具備以下幾個條件：

熒光染料應有較高的量子產額和消光系數；

熒光染料對488nm的激發光波長有較強的吸收；

發射光波長與激發光波長之間應有較大的波長差；

容易與被標記的單克隆抗體結合而不影響抗體自身的特異性。

1.異硫氰酸熒光素（FITC）：可產生亮綠色熒光。FITC是免疫熒光標記最常用的熒光探針。

2.德州紅：與生物素偶聯的抗體有很強的親和力，產生紅色熒光。

3.藻膽蛋白類：主要包括藻紅蛋白（PE）、藻青蛋白（PC）、別藻青蛋白（APC）三類。多發生橙色至紅色熒光。

4.能量傳遞復合染料