單細胞測序方法和原理系列：

所謂DNA文庫，實際上是許多個DNA片段，在兩端接上了特定的DNA接頭，形成的DNA混合物。

文庫有2個特點：

1. 當中這一段插入的DNA，它的序列是各種各樣的。

2. 它的兩頭的街頭序列，是人工特異加上去的，是已知的。

要構建文庫，首先需要把基因組DNA用超聲波打斷，之后把兩端用酶補平。再用Klenow酶在3’端加上一個A堿基，然后再用連接酶把接頭給連上去。連好了接頭的DNA混合物，我們就稱為一個文庫。

Illumina儀器對比。從最早的Miseq一天測三千萬條read，到Hiseq一天測30億條reads，再到Novaseq一天可以測130億條read，通量還是有一個非常大的提升。


文庫構建好之后，后續就是做橋式PCR。橋式PCR是把文庫種到芯片上去然后進行擴增的這樣一個過程。

1）首先要把文庫加到芯片上。芯片的內表面種滿兩種不同類型的oligo(寡核苷酸序列)。因為文庫兩頭的DNA序列和芯片上的引物是互補的，就可以發生互補雜交。

2）隨后加入dNTP和聚合酶，聚合酶會從引物開始，延著模版合成出一條全新的DNA鏈來。新的這條鏈和原來的鏈是完全互補的。

3）接下來加入NaOH堿溶液，DNA在NaOH堿溶液存在的情況下，就解鏈了。液流一沖，原來的模版鏈（沒有和芯片共價連接的鏈）就會被沖走，和芯片共價連接的 鏈就會被保留。

4） 再往液流池中加入中性液體（中和前面加入的堿液），這時DNA鏈上的另外一端就會和玻璃板上的第二種引物發生互補雜交。

5）加入酶和dNTP，聚合酶就沿著第二個引物合成出一條新的鏈來。

6）然后再加堿，把兩條鏈解鏈開，再加入新的中和液，這時候DNA鏈就會和新的引物雜交。再加酶，再加dNTP，又從新的引物上合成出新的鏈來。連續重復這一過程，DNA鏈的數量就會以指數方式增長。

橋式PCR完成之后，接下來需要把合成的雙鏈變成可以測序的單鏈。辦法是通過一個化學反應，把一個引物上的一個特定基團給切斷掉，然后再用堿溶液來洗芯片。堿讓DNA雙鏈解鏈，那根被切斷了根的DNA鏈就被水沖掉了，留下那根共價鍵連在芯片上的鏈。接下來加入中性溶液，再在這個中性溶液里加入測序引物，隨后就可以開始正式的測序工作了。

在測序的時候加進去的主要是兩個東西，一是帶熒光標記的dNTP（3‘末端是被一個疊氮基堵住的），二是聚合酶。聚合酶就會選擇哪個dNTP是和原來位置上的那個堿基是互補的，根據互補性原理，把這個dNTP合成到新的鏈上去。

因為dNTP的3‘端是被一個疊氮基團堵住的，所以它一個循環只能延長一個堿基。合成之后，用水把多余的dNTP和酶給沖掉，放到顯微鏡下去進行激光掃描，根據發出來的熒光判斷它是哪個堿基。因為4種dNTP上面標記的熒光素都不一樣，根據熒光就可以判斷新合成的堿基是什么堿基。因為新合成的堿基和原來位置的堿基是互補的，就可以知道模版鏈的堿基是什么。

一個循環完成之后，就加入一些化學試劑，把疊氮基團和旁邊標記的熒光基團切掉。切掉之后，3‘端的羥基就暴露出來，接下來加入新的dNTP和新的酶，就又延長一個堿基。之后把多余的酶和dNTP沖掉，再進行一輪顯微的激光掃描，判斷堿基是什么。重復這個過程，就可以把上百個甚至更多個堿基的序列讀出來。

因為illumina的測序量很大，但一個樣本往往用不了幾億條DNA。所以科學家就想了一個辦法，在文庫的接頭上做了一些標記，每一個樣本有一個特定的接頭，每個接頭里面有一段特定的序列，這段特定的序列，我們就稱為Index/Barcode（特定序列標記了特定樣本的來源）。

要讀Index序列，先用堿把上面這跟測完‘Read 1’的序列上面的DNA鏈解鏈掉，加入中性液，再加入‘Read 2’的測序引物。Read 2的結合位點就在Index序列的旁邊，接下來進行第二輪測序。一般是讀6-8個堿基。讀完以后就可以知道這某一個具體的一段DNA，它來自原始的哪個樣本。

這是Illumina的最核心的另外一個技術 。雙端測序就是一根DNA鏈，除了從正向讀一遍，還可以從DNA的負向再讀一遍。這樣子就把Illumina測序的有效長度加了一倍。

這個倒鏈的過程，是先讓DNA合成，得到互補鏈。之后用化學試劑切斷模版鏈根部，加入堿溶液洗掉，接下來就進行第2端的測序。原理和第1端是一樣的。

最重要的是，我們可以理解，一個點經過幾百個循環得到一條鏈幾百個堿基的信息。但實際上這個芯片可以有上億個點，也就是上億個cluster（簇）。上億個鏈同時在合成，因此每一個循環都可以讀出上億個序列，這就得到了很大的一個測序數據量。

reads越長，出錯的越多，真實信號會越來越弱。因此illumiina的測序讀長被限制在300bp以內。