稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）是一種評(píng)估抗菌劑抑制微生物生長能力的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，主要包括微量稀釋法和常量肉湯稀釋法兩種方法。瓊脂稀釋法具有操作簡便、成本低廉、適合高通量篩選等優(yōu)勢(shì)，尤其適合自動(dòng)化操作和精確控制藥物濃度。肉湯稀釋法直觀、易于操作，適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的測(cè)試，并且可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整藥物濃度和培養(yǎng)基體積。

瓊脂稀釋法

1、原理

本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法將不同濃度的抑菌劑混合溶解在瓊脂培養(yǎng)基中，然后點(diǎn)種細(xì)菌，通過細(xì)菌的生長與否，確定抗（抑）菌物質(zhì)抑制受試菌生長的最低濃度，即最小抑菌濃度(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)。本方法適用于不溶性抗（抑）菌產(chǎn)品。

2、操作步驟

（1）抗（抑）菌溶液的配制：以無菌操作取5ml或5g（固體研磨后）樣品，放入45ml滅菌磷酸緩沖液中，充分震蕩溶解，配成10%的均勻分散的溶液或懸液。

（2）含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將已配成10%的抗（抑）菌溶液或懸液用PBS做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，置45℃～50℃水浴恒溫備用。

（3）雙倍濃度培養(yǎng)基配制：稱取76gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中。加熱至沸騰溶解。然后121℃壓力蒸汽滅菌15min，置45℃～50℃水浴備用。此培養(yǎng)基將用于稀釋抗（抑）菌溶液或懸液。

（4）含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的配制：分別取10ml系列稀釋的抗菌液加入平皿內(nèi)。將在45℃～50℃水浴中的雙倍MH瓊脂培養(yǎng)基10ml，加入平皿內(nèi)，邊加邊搖晃平板，使抗（抑）菌液和培養(yǎng)基充分混勻，待凝固后備用。

（5）用加樣器取1μl～2μl（含菌量約為107cfu/ml）菌懸液點(diǎn)種于含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的平皿，接種后所形成的菌液圈直徑約5mm～8mm（每個(gè)點(diǎn)菌量約為104cfu）。

（6）以同樣方法接種不含抗（抑）菌成分的MH瓊脂平板，作為陽性對(duì)照。

（7）將接種后的平板放置35℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。

3、評(píng)判規(guī)定

菌落生長被完全抑制的最低抗（抑）菌液濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。單一菌落生長可忽略不計(jì)。

營養(yǎng)肉湯稀釋法

1、原理

本試驗(yàn)將不同濃度的抑菌劑混合溶解于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后接種細(xì)菌，通過細(xì)菌的生長與否，確定抗（抑）菌劑抑制受試菌生長的最低濃度，即最小抑菌濃度(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)。本方法式用于可溶性抑菌產(chǎn)品。

2、操作步驟

（1）按2.1.1.2所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液

（2）含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將抗（抑）菌溶液用蒸餾水做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，取各稀釋度受試液2.5ml加入到含2.5ml雙倍濃度營養(yǎng)肉湯的試管中。

（3）取0.1ml含菌量約為108cfu/ml菌懸液接種于含抗（抑）菌劑的營養(yǎng)肉湯的試管中，作為試驗(yàn)組樣本。

（4）以同樣方法接種不含抗（抑）菌劑的營養(yǎng)肉湯的試管中，作為陽性對(duì)照組樣本。

（5）取2支含營養(yǎng)肉湯的試管中，作為陰性對(duì)照組樣本。

（6）將試驗(yàn)組樣本、陽性對(duì)照組樣本及陰性對(duì)照組樣本放置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。

（7）試驗(yàn)中應(yīng)將試驗(yàn)用菌懸液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，其作用濃度應(yīng)為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。

3、評(píng)判規(guī)定

當(dāng)陽性對(duì)照管有細(xì)菌生長(混濁)，陰性對(duì)照管無菌生長(透明)，試驗(yàn)用菌懸液的作用濃度為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml時(shí)，試驗(yàn)組無菌生長的最高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抗（抑）菌劑濃度，為該樣品對(duì)受試菌的MIC。