大腸桿菌是生物領(lǐng)域最常用的工程菌之一，具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)成本低、基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善等優(yōu)勢(shì)，其質(zhì)粒常被用作基因工程中的載體，在基因的分子克隆、疫苗研發(fā)、重組蛋白類藥物的表達(dá)和生產(chǎn)等領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用，但同時(shí)需要嚴(yán)格控制相關(guān)生物制品中內(nèi)毒素的殘留水平。

1、內(nèi)毒素簡(jiǎn)介

內(nèi)毒素位于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的最外層，覆蓋于細(xì)胞壁的黏肽上，化學(xué)成分是磷脂-多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要毒性成分是脂多糖(LPS)中的類脂A，只有當(dāng)菌體死亡溶解或者用人工方法破壞菌體細(xì)胞后內(nèi)毒素才釋放出來(lái)。

內(nèi)毒素能夠直接作用于人體，通過(guò)與宿主細(xì)胞上的Toll樣受體（TLR）結(jié)合激活組織內(nèi)的炎性細(xì)胞及炎癥因子，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱并產(chǎn)生全身炎癥性反應(yīng)，繼而引起彌散性血管內(nèi)凝血、休克、多臟器功能衰竭等嚴(yán)重的病理生理癥狀，又稱之為“熱原”。內(nèi)毒素具有極強(qiáng)的生物活性，即使是微量也會(huì)引起機(jī)體的各種炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。

內(nèi)毒素還具有較好的耐熱性和穩(wěn)定性，在60℃的溫度下加熱數(shù)小時(shí)也不會(huì)被破壞，完全滅活需在180℃高溫下加熱3小時(shí)以上，一般的化學(xué)藥品也不會(huì)影響細(xì)菌內(nèi)毒素的活性，只有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或強(qiáng)氧化劑可以破壞其結(jié)構(gòu)。

2、內(nèi)毒素的檢測(cè)方法

內(nèi)毒素可以與特定的檢測(cè)試劑發(fā)生反應(yīng)，基于這一原理開發(fā)出內(nèi)毒素的檢測(cè)方法。常見(jiàn)的檢測(cè)方法包括凝膠法、重組C因子法、動(dòng)態(tài)比濁法等。

鱟試劑中的C因子是對(duì)內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠與內(nèi)毒素結(jié)合并被激活，從而啟動(dòng)整個(gè)鱟試劑血凝級(jí)聯(lián)反應(yīng)，凝膠法根據(jù)該原理來(lái)檢測(cè)內(nèi)毒素，并通過(guò)觀察有無(wú)凝集素形成作為反應(yīng)的終點(diǎn)。該方法簡(jiǎn)便易操作且不需要使用光學(xué)檢測(cè)儀，但檢測(cè)范圍存在一定的局限性。

鱟試劑的制備需要捕捉大量的鱟并抽取其血液，隨著對(duì)鱟的保護(hù)以及重組技術(shù)的發(fā)展，新一代人工合成的重組C因子開始被用于內(nèi)毒素的檢測(cè)中。重組C因子被內(nèi)毒素活化后能夠與熒光底物作用產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與內(nèi)毒素濃度成正比關(guān)系，可據(jù)此來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量。該檢測(cè)方法不存在G因子旁路干擾，具有較高的特異性，可用于含有β-葡萄糖干擾的樣品檢測(cè)。

動(dòng)態(tài)比濁法可通過(guò)光學(xué)測(cè)定儀測(cè)定反應(yīng)混合物達(dá)到預(yù)定OD值所需時(shí)間和濁度變化的速率，檢測(cè)數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量，還能起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警作用。

3、內(nèi)毒素的去除方法

由于內(nèi)毒素具有顯著的危害性，F(xiàn)DA等法規(guī)也對(duì)內(nèi)毒素控制提出明確要求。首先要從源頭消除外源性內(nèi)毒素污染，在生物藥物研發(fā)及生產(chǎn)過(guò)程中，要確保與樣品直接接觸的設(shè)備、容器、儲(chǔ)液袋、原輔料、耗材等經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒滅菌處理。其次對(duì)于樣品本身就存在的內(nèi)源性內(nèi)毒素污染，需要從樣品本身制備工藝角度出發(fā)，尋找合適方法，如離子交換層析法、疏水層析法、特異性吸附等。

離子交換層析法：根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物與內(nèi)毒素在緩沖液中的帶電性質(zhì)差異，可以利用離子交換層析的方法去除內(nèi)毒素。陰離子交換層析主要通過(guò)改變緩沖液的離子強(qiáng)度使內(nèi)毒素分子帶大量負(fù)電荷，能夠與帶正電荷的配基結(jié)合，從而將其去除；陽(yáng)離子交換層析主要采用吸附模式，通過(guò)改變緩沖液的pH使帶正電荷的目的蛋白吸附在離子交換介質(zhì)上，帶負(fù)電荷的內(nèi)毒素流穿，實(shí)現(xiàn)分離。

疏水層析法：內(nèi)毒素在高鹽條件下會(huì)聚集成大多不與疏水填料結(jié)合的復(fù)合物，上樣時(shí)直接穿透而被去除。或者采取目標(biāo)樣品流穿模式，在一定鹽濃度下使目的蛋白不與填料結(jié)合而內(nèi)毒素分子可與其結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)分離。

特異性吸附：將多粘菌素B偶聯(lián)于層析介質(zhì)上，通過(guò)介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素，蛋白因不會(huì)被該層析介質(zhì)吸附而隨流動(dòng)相流出，收集該流出蛋白即可。該方法去除內(nèi)毒素效果較好,但有一定的蛋白損失。

此外，還可以依據(jù)內(nèi)毒素在不同的水溶液中形成的聚集體分子量大小差異，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析和切向流膜過(guò)濾技術(shù)等方法將其去除。