人鐵蛋白(FE)ELISA試劑盒使用說明書
    僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
    本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人鐵蛋白（FE）的含量。
    有效期：6個月
    保存條件：2-8℃

    實驗原理
    試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人鐵蛋白（FE）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的人鐵蛋白（FE）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

    樣本處理及要求
    1.血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
    4.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    注：標(biāo)本溶血會影響后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。

    需要而未提供的試劑和器材
    1.酶標(biāo)儀（450nm）
    2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
    3.37℃恒溫箱
    4.蒸餾水或去離子水

    試劑盒組成
    名稱96孔配置48孔配置備注
    微孔酶標(biāo)板8孔×12條8孔×6條無
    標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6管0.3mL*6管無
    樣本稀釋液6mL3mL無
    檢測抗體-HRP10mL5mL無
    20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進行稀釋
    底物A6mL3mL無
    底物B6mL3mL無
    終止液6mL3mL無
    封板膜2張2張無
    說明書1份1份無
    自封袋1個1個無
    空白稀釋板1塊1塊選配
    橡膠手套2副2副選配

    備注：
    1.標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：120、60、30、15、7.5、3.75ng/mL
    2.經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗。

    注意事項
    1.嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
    2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
    3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
    4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
    5.避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
    6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
    8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
    9.不能使用過期產(chǎn)品。
    10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

    試劑準(zhǔn)備
    試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
    20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

    操作步驟
    1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
    2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
    3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
    4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
    5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
    6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
    7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

    實驗結(jié)果計算
    以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

    試劑盒性能
    1.檢測范圍：3.75ng/mL–120ng/mL。
    2.靈敏度：低檢測濃度小于0.1ng/mL。
    3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
    4.重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于15%。