微生物操作中常見問題的討論與分析

    1、劃不出單個(gè)菌落的原因：

    （1）平板上有過多的水分；

    （2）劃線時(shí)接種環(huán)未經(jīng)反復(fù)灼燒；

    （3）多區(qū)劃線，三區(qū)或四區(qū)劃線。

    2、涂布和傾注的區(qū)別：

    涂布利于觀察，但由于涂布棒上會(huì)帶有少量的菌液，可能影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性；傾注更為準(zhǔn)確，但不利于觀察菌落的狀態(tài)。

    Beuchat和Matsuda等人分別對(duì)這兩種方法作了大量比較試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)霉菌計(jì)數(shù)來說，涂抹法有以下幾方面優(yōu)越于傾注法：

    ①培養(yǎng)出的霉菌菌落數(shù)較多；

    ②培養(yǎng)所需的時(shí)間較短；

    ③霉菌孢子、菌落形態(tài)特征發(fā)育完全，便于鑒定。

    這是因?yàn)榻^大多數(shù)霉菌是好氧的，在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)快，發(fā)育好，而混在培養(yǎng)基中發(fā)育就受影響，而且在培養(yǎng)基傾注時(shí)霉菌孢子易受熱損傷。

    3、培養(yǎng)基的選擇：

    培養(yǎng)基的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料和檢驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。目前國標(biāo)方法中使用的培養(yǎng)基有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、孟加拉培養(yǎng)基(RBC)、高鹽察氏培養(yǎng)基(CAO)，其中PDA和RBC適合于一般的霉菌和酵母菌生長(zhǎng)，而CAO則適合于高滲性霉菌生長(zhǎng)，酵母菌幾乎不長(zhǎng)。

    在日常檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn)，有些常見的耐高滲性霉菌，如局限曲霉、謝瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生長(zhǎng)非常緩慢或不長(zhǎng)，而這些菌在高滲培養(yǎng)基如M40Y、DG18(M40Y瓊脂配方：蔗糖400g，麥芽提取汁20g，酵母提取汁5g，瓊脂20g，氯霉素50mg，蒸餾水1000ml；DG18瓊脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，氯霉素0.1g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，PH6.5)上則正常生長(zhǎng)。孢子、形態(tài)特征發(fā)育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生長(zhǎng)，因此，若能同時(shí)采用PDA和M40Y(或DG18)分離培養(yǎng)各類樣品中的霉菌，將能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特別是對(duì)干燥食品、高糖食品、淹漬食品等，更有必要同時(shí)采用M40Y或DG18。

    由于霉菌中很多種類不會(huì)產(chǎn)生有毒的霉菌毒素，危害較小，而有的菌株即使污染數(shù)量不多，但其產(chǎn)生的霉菌毒素卻危害較大，因此僅作霉菌計(jì)數(shù)并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判斷被污染食品的安全程度。

    為此，國外有些研究者設(shè)計(jì)出各類選擇性培養(yǎng)基，可以識(shí)別產(chǎn)毒的霉菌。如AFPA培養(yǎng)基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,檸檬酸鐵銨0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,PH5.6)用于分離黃曲霉毒素產(chǎn)生菌高污染率的食品。產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株黃曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培養(yǎng)2~3天就形成背面有亮橙黃色的特征性菌落，非常容易識(shí)別。有人利用該培養(yǎng)基分離黃曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了滿意的結(jié)果。因此,針對(duì)不同樣品,有目的地設(shè)計(jì)出相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基,以篩選污染菌中的危險(xiǎn)菌群,將是一個(gè)值得探索的方向。

    4、培養(yǎng)基配制時(shí)應(yīng)注意的問題：

    (1)滅菌溫度要嚴(yán)格控制，按照要求滅菌，尤其含糖量較高的培養(yǎng)基溫度不應(yīng)太高，過高會(huì)導(dǎo)致糖分焦化，影響質(zhì)量；

    (2)瓊脂培養(yǎng)基不能反復(fù)溶化。反復(fù)溶化會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分；

    (3)培養(yǎng)基不能反復(fù)滅菌，反復(fù)滅菌也會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)成分的破壞；

    (4)含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌后，要搖勻。

    5、平板的保存：

    大多數(shù)平板如VRBA、DC、尿素酶生化管、顯色系列等要避光低溫保存。

    6、產(chǎn)品的保存：

    (1)干粉培養(yǎng)基：避光干燥，結(jié)塊后不能使用。

    (2)亞碲酸鉀卵黃增菌液、50%卵黃乳液等：冷凍保存，使用時(shí)，要常溫解凍，避免水浴加熱。

    (3)抗生素類：冷藏保存，溫度過高會(huì)導(dǎo)致靈敏度的下降。

    (4)兔血漿：冷藏保存少量的紅色不會(huì)影響結(jié)果。

    7、添加劑的添加：

    （1）溫度的掌握。卵黃和抗生素類添加的溫度都不應(yīng)太高。

    （2）定量。過多會(huì)抑制一些目標(biāo)菌，太少又導(dǎo)致雜菌的過度生長(zhǎng)。

    8、培養(yǎng)溫度的掌握：

    （1）真菌類。25-28℃培養(yǎng)

    （2）細(xì)菌類。李氏菌在增菌和生化中要求培養(yǎng)溫度在30℃左右。

    （3）其他，一般在36℃左右。

    9、接種方法：

    常用的方法主要有劃線、三點(diǎn)接種、穿刺接種、傾注接種、涂布接種、液體接種。

    10、革蘭氏染色方法：

    染色時(shí)間的掌握、沖洗的方法。

    11、生化實(shí)驗(yàn)：

    （1）接種的方法

    （2）氧化型和發(fā)酵型實(shí)驗(yàn)操作

    （3）陽性菌種的對(duì)照

    （4）接種前的純化。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行一系列的生化。

    12、最適計(jì)數(shù)范圍

    霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當(dāng)擴(kuò)散，在直徑9cm的平皿里，菌落數(shù)稍多就相互交叉重疊，影響計(jì)數(shù)，但數(shù)量太少又會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，因此選擇適當(dāng)?shù)南♂尪扔?jì)數(shù)是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

    我們對(duì)這方面作了一些觀察研究，首先是將實(shí)驗(yàn)菌株的斜面培養(yǎng)物制成含有約106個(gè)/ml的孢子懸液，并用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，然后將孢子懸液作10-1~10-6倍稀釋，吸取不同稀釋度的稀釋液接種于PDA，25℃培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)。30種常見霉菌的兩種不同計(jì)數(shù)方法所得結(jié)果比較顯示，大部分菌株每平板含有10~50個(gè)菌落的稀釋度時(shí)的計(jì)數(shù)與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果最接近；有近一半的菌株，每個(gè)平板含50~100個(gè)菌落已較難計(jì)數(shù)，而大部分菌株，超過100個(gè)/平皿或小于10個(gè)/平皿的計(jì)數(shù)結(jié)果就與顯微計(jì)數(shù)結(jié)果存在較大差別，因此，應(yīng)盡量選擇10~50個(gè)/平皿的稀釋度進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。

    而對(duì)上述提及的菌絲很豐富、菌落特別擴(kuò)散的毛霉、根霉、犁頭霉等菌株，則應(yīng)在更少的范圍內(nèi)計(jì)數(shù)(30個(gè)/平皿以內(nèi))。為控制霉菌的生長(zhǎng)速度和菌落的生長(zhǎng)范圍，可在培養(yǎng)基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，慶大霉素(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。

    13、關(guān)于殺菌的幾個(gè)概念：

    （1）抑制：是在亞抑制劑量因子作用下導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)停止，但在移去這些因子后生長(zhǎng)仍可以恢復(fù)的生物學(xué)現(xiàn)象。

    （2）死亡：在致死劑量因子的作用下或在亞致死劑量因子長(zhǎng)時(shí)間的作用下，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)能力不可逆喪失，即使移去這種因子后生長(zhǎng)仍不能恢復(fù)的生物學(xué)現(xiàn)象。

    （3）防腐：在某些化學(xué)物質(zhì)或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生長(zhǎng)的一種措施，它能防止食物腐敗或防止食物霉變。

    （4）消毒：利用某種方法殺死或滅活物質(zhì)或物體中所有病原微生物的一種措施，它可以起到防止感染和傳播的作用。

    （5）滅菌：利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內(nèi)的所有病原微生物的一種措施。

    （6）化療：利用具有選擇毒性的化學(xué)物質(zhì)，例磺胺、抗生素等對(duì)生物體內(nèi)部被微生物感染的組織或病變細(xì)胞進(jìn)行治療，以殺死組織內(nèi)的病原微生物或病變細(xì)胞，但對(duì)有機(jī)體無毒害作用的治療措施。