葡聚糖凝膠操作步驟及注意事項
2018-02-26 17:24 作者：洛辰 來源：上海遠慕生物試劑
摘要：葡聚糖凝膠(Sephadex)是白色珠狀顆粒，由葡聚糖經醚鍵相互交聯聚合而成具有多孔性三度空間網狀結構的高分子分離材料，為穩定的親水性凝膠，在水中和電解質中很容易溶脹。
葡聚糖凝膠指的是由一定平均相對分子質量的葡聚糖(dextran) 和甘油基以醚橋形式相互交聯而成，具有立體網狀結構，應用面廣的一類凝膠，國外商品名為Sephadex。
1、乙醇浸泡：在室溫下，將干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小時，并不斷攪拌以保證凝膠溶脹，用無鹽水洗去殘存的乙醇濾干。
2、無鹽水浸泡：室溫下，在無鹽水中充分溶脹24小時，間隙攪拌，以保證凝膠的完全溶脹。
3、鹽酸浸泡：在常溫下再用0.1MHCl浸泡12小時，間隙攪拌，濾干，水洗只中性。
4、裝柱：層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時，柱床體積應為樣品體積的25～100倍。去除鹽及游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細，會發生“器壁效應”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對于除鹽來說應為1︰5～1︰25;對于純化蛋白質來說應為1︰20～1︰100。凝膠柱的裝填方法和要求，基本上與離子交換柱的制備相同。一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一致，沒有空隙和氣泡。通常新裝的凝膠柱用適當的緩沖溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖–2000、細胞色素，或血紅蛋白等物質配制成質量濃度為2g/L的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術質量是否合格，否則，必須重新裝填。
5、平衡：上樣前平衡層析柱至少3-5個柱體積直到記錄儀基線變得平穩為止(流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值)。
6、上樣：凝膠過濾的上樣量一般為5%的柱床體積，我們建議初次上樣控制在1-2%的床體積，視分離情況可以調整;脫鹽時上樣量可以達到20%的柱床體積，柱高的選擇也與分離要求相關，柱高控制在40-50cm以下，過高的凝膠層會引起較大的反壓，應當盡可能避免。難分離物質要有一定柱高和流速控制，脫鹽時高徑比為5：1即可。
7、洗脫方法：可以用無鹽水，也可以采用上柱時的緩沖液洗脫;在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脫或鹽梯度洗脫也可以完全分離純化。
8、清洗：每次用完之后，將柱子里的緩沖液置換為去離子水，然后用20%的乙醇封存。
9、在位清洗(CIP)：凝膠使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床內沉淀的及頑固殘留的蛋白。方法是以40cm/h用0.1M氫氧化鈉反向洗四個柱體積，再以至少三個柱體積平衡緩沖液再生。
10、保存：凝膠使用完后，可將其回收，可將凝膠用超純水沖洗干凈并濾干，加入0.02%的疊氮鈉做為防腐劑，或者浸泡在20%的乙醇中，防止長菌。
葡聚糖凝膠注意事項：
凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時甚至可用蒸餾水；洗脫時用于流速控制的裝置最好的是恒流泵；若無此裝置，可用控制操作壓的辦法進行；樣品體積不宜過多，最好為床體積的1%～5%，最多不要超過10%；樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。
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