通過免疫熒光對樣本進行染色，整個流程和化妝（護膚、妝前乳、底妝、彩妝，和定妝）一樣，有五個步驟。免疫熒光染色是如何一步步實現「化妝」的呢？小博同學下面會一一分解（藍孩子們，聽到「化妝」不要打瞌睡嘛，這可是關乎你們畢業大計的寶貴知識哦）。
「基礎護膚」--固定樣本
和基礎護膚的目的一樣，固定的目的就是為了長久保持細胞的狀態，讓樣本「容顏永駐」，「宛如生時」。
通過化學試劑處理樣本，從而固定細胞結構和蛋白分布。免疫熒光的固定劑可以分為交聯類固定劑和有機溶劑類固定劑。交聯類固定劑大多采用的是甲醛、多聚甲醛等醛類物質，這一類固定劑通過醛基與蛋白質發生交聯反應，形成網絡，保持蛋白質的位置和結構，是最常用的固定劑。在少數情況下，可能會用到有機溶劑類固定劑，如甲醇、丙酮等。它們是通過變性蛋白質的方式對組織進行固定。具體使用何種樣本固定劑，可查看特定的抗體說明書。（圖 1） 「妝前乳」——通透細胞膜
固定好樣本的「容貌」之后，為了幫助「化妝品」進入細胞，貼合抗原，需要進行細胞膜通透的步驟。
通透，就是在細胞膜上打孔，使封閉液和抗體能夠進入細胞。一般情況下，采用醛類固定劑固定的樣本需通透細胞膜，而有機溶劑類固定劑本身就可以通透細胞膜，固定后的細胞不需要再增加通透步驟。通透一般采用表面活性劑 Triton-XTM 100，少數情況下，采用甲醇作為通透劑會得到更好的染色效果。抗體說明書上會標注出合適的通透劑。（圖 2） 「底妝」——封閉抗體非特異性結合位點
「底妝」是為了遮蓋皮膚的瑕疵，保證后續「妝容」的清爽干凈。免疫熒光里，抗體的非特異性結合會導致樣本的「妝容」出現瑕疵，需要用「封閉液」上點「底妝」「遮瑕」——封閉掉非特異性結合位點。封閉液一般采用與二抗同來源的血清。
作為「底妝」的封閉液雖然常常扮演幕后英雄的角色，不引人注意，但是，如果封閉液質量不好，孵育抗體之后很可能出現很多雜點，輕則影響美觀，重則掩蓋抗體的特異性信號，毀掉整個免疫熒光樣本。而 Troubleshooting 的時候往往會先從抗體上找原因，兜兜轉轉換了好多抗體也得不到滿意的結果，白白浪費很多時間。所以，不要小看「底妝」對「妝容」的影響，慎選封閉液才能保證「妝容」通透干凈。
「彩妝」——孵育一抗/二抗、細胞核復染
經過前面一系列的處理，我們的「模特」已經擁有了無瑕的美肌。下面，讓我們期待「模特」的「彩妝」大變身。
化妝時，需「彩妝」修飾妝容，免疫熒光中，則是用抗體標記樣本的特點，并添加絢麗的色彩。其中，一抗用來識別樣本中的抗原，定位「彩妝」，二抗用來放大信號、增加色彩。
一抗
一抗決定「彩妝」的定位，其特異性和靈敏度是免疫熒光成功與否的關鍵。如果一抗靈敏度不高，不能體現樣本的「上妝」效果，如果特異性不強，「妝容」就會臟兮兮的，哪哪兒都是。更有特異性差的抗體，明明應該識別核蛋白，卻在胞質里玩的不亦樂乎，使整個熒光結果「面目全非」。
去哪里才能找到最合適免疫熒光一抗呢？小博經過多年苦心驗證，吐血推薦 CST！！！這里的抗體質量穩定，靈敏度高、特異性強，是免疫熒光成功的不二法門。（圖 3） 二抗
有的一抗偶聯了熒光基團，可以直接為免疫熒光的樣本提供絢麗的色彩（圖 4）。但是更多的情況下，一抗不帶有熒光標記，需要偶聯熒光基團的二抗與一抗結合，放大樣本信號，并且添加耀眼的「彩妝」效果（圖 5）。 選擇二抗時除了要與一抗匹配之外，還要考慮熒光基團的顏色、穩定性等因素對成像效果的影響。
1）熒光基團的顏色：每一個熒光基團都有它特定的激發光譜和發射光譜，選擇熒光基團的時候，既要考慮實驗的需求，也要考慮顯微鏡的光源和濾光片配置。常見熒光基團的激發光和發射光如下（表 1）所示： 2）熒光基團的穩定性：熒光基團長時間暴露在光下（尤其是顯微鏡的汞燈、激光器等強光源下），容易發生淬滅。好不容易做好的片子，剛剛在顯微鏡下調好視野準備拍照，熒光信號就淬滅了，這種感覺就好像花了一早晨時間畫了個美美的妝，結果剛出門就趕上一場大雨，「脫妝」了，實在太讓人沮喪了。
為了防止「脫妝」，建議選用 Alexa Fluor??系列或 DyLight??系列的熒光基團標記的抗體。這類熒光基團具有更強的信號強度，更好的光穩定性，耐受更廣泛的 pH 范圍，可以很好地減少熒光淬滅。目前，CST 用于免疫熒光的二抗，都是 Alexa Fluor??系列基團標記的。
細胞核復染
用抗體對樣本上完「彩妝」之后，還可以復染細胞核對「妝容」進行修飾。復染的染料也有多種選擇（表 2）。
復染可以在二抗孵育后單獨進行，也可以采用含有 DAPI 的封片劑直接封片 (#8961)，省略單獨復染的步驟。 「定妝」——封片
「彩妝」上完后，不要著急進影棚拍片，還需上點「定妝液」，防止「脫妝」。
免疫熒光樣本的「定妝液」是防熒光淬滅的封片液，當然推薦 CST 的 ProLong?? Gold Antifade Reagent (#8961，#9071)，它對熒光淬滅具有很好的抑制效果，可以保持「彩妝」持久靚麗。使用這種封片液時，蓋好蓋玻片后記得將載玻片放在黑暗處固化 24 hr，達到最佳的防淬滅效果。之后，就可以涂上美美的指甲油進行封片啦。（圖 6） 以上，就是一個樣本小「模特」成功進階為免疫熒光界的「吉賽爾·邦臣」的「化妝」大法，有了美艷的「超模」，再配上一點點拍照技巧，您期待的「美艷不可方物」的免疫熒光大片就呼之欲出了。