實驗原理:
  攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在 37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni²⁺）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。

實驗步驟:

一、試劑準備
 

1.  LB液體培養基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸餾水配至1000 mL。
 

2.  氨芐青霉素：100 mg/mL。
 

3.  上樣緩沖液：100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris，8M Urea，10 mM  2-ME，pH8.0。
 

4.  Washing Buffer：100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
 

5.   Elution Buffer：100 mM NaH₂PO₄，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。
 

6.   IPTG：100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。

五、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導
 

1.   接種含有重組氯霉素酰基轉移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mL LB液體培養基中（含100 ug/mL 氨芐青霉素），37℃震蕩培養過夜。
 

2.  按1∶50或1：100的比例稀釋過夜菌，一般轉接1 mL過夜培養物于100 mL（含100 ug/mL 氨芐青霉素）LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD₆₀₀ = 0.6 - 0.8（最好0.6，大約需3 h）。取10 ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.   對照組不加誘導劑，實驗組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l，37℃繼續培養1-3h。
 

4.  12 000 rpm 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
 

六、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離、純化
 

1.  NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1 mL NTA介質，并分別用8 mL 去離子水，8 mL上樣緩沖液洗滌。
 

2.  重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5 mL上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取10 ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.  上清樣品以10-15 mL/h 流速上Ni²⁺-NTA柱，收集流出液，取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
 

4.  洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD₂₈₀ = 0.01分步收集洗脫液，約3-4 h，取10 ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE 分析。
 

5.  洗脫目標蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 級分，分別取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。

注意事項: