研究背景
Geobacter是一種發(fā)電菌屬，其細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移（EET）能力在生物地球化學(xué)和生物能源過程中發(fā)揮重要作用，作者選擇Geobacter soli GSS01菌種，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)希望揭示EET在不同Geobacter菌種之間的差異。
研究結(jié)果
1. G.soli的細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移（EET）能力
作者培養(yǎng)了G.soli和G.sulfurreducens PCA兩種菌株，發(fā)現(xiàn)這兩種菌株都能夠還原四種常見的不溶性Fe（III）氧化物。隨著培養(yǎng)時間的延長，GSS01菌株還原生成的Fe（II）產(chǎn)物量比PCA菌株多，這些結(jié)果表明GSS01菌株可能比PCA菌株更快地還原Fe（III）氧化物。在電流密度和電流強度方面，GSS01菌株也高于PCA菌株。
圖1 G.soli GSS01和G.sulfurreducens PCA 的EET能力比較
2. G.soli生物膜的生物電化學(xué)特征
為了準(zhǔn)確識別出負(fù)責(zé)發(fā)電的生物催化活性位點，作者使用non-turnover CV法和turnover DPV法分析菌株生物膜，發(fā)現(xiàn)兩種生物膜均顯示出兩個主要的氧化還原狀態(tài)（E2、E3）和一種次要氧化還原狀態(tài)（E1）。而且G.soli生物膜中也存在一個獨特的次要氧化還原狀態(tài)，其形式電位為-0.20 V（E4）。除此之外，EIS分析顯示，G.solid 生物膜具有比G.sulfurreducens更低的電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct）。
圖2 G.soli GSS01和G.sulfurreducens PCA 生物膜電化學(xué)結(jié)果
3. 外氧化還原蛋白的電化學(xué)原位 FTIR光譜
作者采用電化學(xué)原位 FTIR光譜獲得更多關(guān)于G.soli細(xì)胞表面蛋白的信息，并在分子水平上監(jiān)測它們在電化學(xué)反應(yīng)過程中的構(gòu)象變化。結(jié)果顯示，對于用FC和ITO生長的G.soli細(xì)胞，在1552、1458、1400、1248和1150cm-1處出現(xiàn)正帶。與用在1650cm-1處具有明顯條帶的FC生長的細(xì)胞的光譜相比，用ITO生長的G.soli細(xì)胞的光譜在1700-1600cm-1處具有一個更寬的條帶。此外，圖3 C的帶肩從1640移動到1670cm-1，電位從-0.7增加到0.3V，并且在-0.1V 處將該帶分成1668和1620cm-1處的兩個帶。不同光譜振動反映了由電子受體引起的G.soli細(xì)胞的外部蛋白質(zhì)的獨特模式。酰胺I帶和其他帶的顯著差異表明，在G.soli和G.sulfurreducens之間有獨特的外部氧化還原蛋白促進(jìn)兩種Geobacter菌種的電化學(xué)行為。由于具有較高氧化還原電位的外表面蛋白將促進(jìn)電子從周質(zhì)向外傳遞，作者推測額外的氧化還原蛋白一方面可能有助于提高G.soli的EET能力，另一方面表明在G.soli中可能存在未知的電子傳遞導(dǎo)管。
圖3 電化學(xué)原位 FTIR光譜分析結(jié)果
4. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析
在轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果中，作者分別鑒定到了2013（FH vs FC）、1705（ITO vs FC）差異基因（Pvalue≤0.05），在蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中，共鑒定到了2149個蛋白質(zhì)，差異蛋白數(shù)分別為409（FH vs FC）、207（ITO vs FC）（FC≥1.5，Pvalue≤0.05）。作者發(fā)現(xiàn)，許多在轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中具有較高轉(zhuǎn)錄水平的基因，例如cbcL、imcH、rplE和rplN，在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中具有降低的翻譯水平，這可能是因為膜相關(guān)蛋白的低提取產(chǎn)率或表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。
5. 與代謝和生長相關(guān)的蛋白質(zhì)
在本次研究中，作者選擇了與三羧酸（TCA）循環(huán)、氧化磷酸化和翻譯相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。
在TCA循環(huán)中，使用FH和ITO的細(xì)胞生長期間，與代謝率直接相關(guān)的檸檬酸合酶（GltA）的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析中均下調(diào)。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中，三種琥珀酸脫氫酶編碼基因（frdA，frdB和frdC）、蘋果酸脫氫酶（mdh）和異檸檬酸脫氫酶（icd）編碼基因的表達(dá)水平下調(diào)。TCA循環(huán)中許多基因的轉(zhuǎn)錄水平，如frdB和烏頭酸氫鹽編碼基因acnA，在用ITO生長的細(xì)胞中的蛋白豐度比在用FH生長的細(xì)胞蛋白豐度更低，說明用ITO生長的細(xì)胞中的代謝率較低。
在使用FH或ITO細(xì)胞生長期間，催化呼吸代謝反應(yīng)酶的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，F(xiàn)0F1型ATP合酶的一個亞基（AtpH）在用FH生長的細(xì)胞中比在FC中表達(dá)量上調(diào)，而另一個亞基（AtpG）則表達(dá)量下調(diào)；在轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中，細(xì)胞色素c氧化酶（CoxA、CoxC和CoxD）的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞色素bd甲基萘醌氧化酶（CydA）的表達(dá)下調(diào)。這和已有的G.sulfurreducens研究結(jié)果一致，即兩種NADH脫氫酶復(fù)合物在所有測試條件下均表達(dá)，但不同亞基的豐度是不同的。一般來說，大多數(shù)亞基在FH生長過程中比FC更豐富，但在ITO生長過程中豐度低于FC，這也表明使用ITO生長的細(xì)胞代謝率低于FH。
更多的核糖體產(chǎn)生表明微生物有更快的生長速率。蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，許多核糖體蛋白在FH和ITO培養(yǎng)的細(xì)胞中的豐度比FC低約1.5-25倍，這支持了不溶性電子受體細(xì)胞生長較慢的結(jié)論。然而，大多數(shù)這些核糖體蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平在用FH和ITO生長的細(xì)胞中比在FC中更豐富。該結(jié)果表明核糖體蛋白的表達(dá)高度依賴于如前所述的轉(zhuǎn)錄后控制。
圖4 G.soli細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平比較
圖5 G.soli細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較
6. 可能參與EET的蛋白質(zhì)
作者認(rèn)為可能參與EET的蛋白主要包括細(xì)胞色素蛋白、菌毛相關(guān)蛋白、額外的電子轉(zhuǎn)移蛋白、小的非編碼RNA（sRNA）等。
目前來自G.sulfurreducens研究表明，許多c-Cyt蛋白在EET中起重要作用：（1）內(nèi)膜電子轉(zhuǎn)移至少通過兩種不同的途徑，分別為CbcL-依賴途徑和ImcH-依賴途徑；（2）從內(nèi)膜到外膜的電子轉(zhuǎn)移可能是由PpcA家族（PpcA-PpcE）介導(dǎo)；（3）通過外膜轉(zhuǎn)移電子依賴于反式外膜孔；（4）從外膜到電子受體的末端電子轉(zhuǎn)移由OmcS和OmcZ介導(dǎo)。
在轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中，共有62個c-Cyts顯著差異編碼基因，其中有23個在兩組中表達(dá)皆上調(diào)。基因cbcL和imcH的表達(dá)在用FH生長的細(xì)胞中分別上調(diào)7.6和2.1倍，而在用ITO生長的細(xì)胞中沒有明顯變化。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，蛋白質(zhì)cbcL在用FH生長的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。由于FC，F(xiàn)H和ITO的氧化還原電位彼此不同，含有FC和FH的培養(yǎng)物的氧化還原電位將隨著Fe（III）還原而降低，說明這兩種蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)不僅直接依賴于電子受體的類型，而且還依賴于培養(yǎng)物中Fe（III）-還原比率。
在五個密切相關(guān)的小型三聚體c -Cyts PpcA家族中，ppcB、ppcC和ppcE的轉(zhuǎn)錄水平在用FH生長的細(xì)胞中上調(diào)，而ppcD在用ITO生長的細(xì)胞中比在FC中具有更高的轉(zhuǎn)錄水平。作者推測這些蛋白質(zhì)均通過PSORT進(jìn)行周質(zhì)定位。
omcB基因在FH和 ITO生長的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，但它的翻譯水平在蛋白質(zhì)組分析結(jié)果顯示并沒有明顯變化。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，用FH或ITO生長的細(xì)胞中兩個表達(dá)上調(diào)的蛋白的c-Cyts是SE37_02820和SE37_11760，而在G.sulfurreducens中最接近SE37_02820的同源物是OmcS，具有94.7％的氨基酸序列同一性。之前G.sulfurreducens中的研究證實，OmcS是末端Fe（III）氧化物還原酶，但對于電極還原不是必需的。OmcZ在促進(jìn)從生物膜到電極表面的電子轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用，已發(fā)表的研究結(jié)果認(rèn)為omcZ的轉(zhuǎn)錄水平在不可溶電子受體中表達(dá)大幅度上調(diào)。然而，在本研究中作者發(fā)現(xiàn)，與FC生長的細(xì)胞相比，在FH和ITO生長的細(xì)胞中omcZ（SE37_04285）轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著降低。
表1部分重要的c- Cyt蛋白和可能參與EET的其他蛋白質(zhì)
細(xì)菌中的許多外膜蛋白都是通過sRNA調(diào)節(jié)的，而外膜蛋白對EET很重要，因此sRNA的差異表達(dá)同樣很重要。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)顯示，在用不溶性電子受體和可溶性受體生長的G.soli細(xì)胞中差異表達(dá)30種新型sRNA，差異表達(dá)最大的sRNA是sGS014。為了進(jìn)一步研究sRNA在EET中的潛在作用，作者使用RNA相互作用預(yù)測工具IntaRNA分析差異表達(dá)的sRNA和EET基因之間的相互作用，結(jié)果顯示sGS014可以與30個EET基因相互作用，并且預(yù)測兩個外膜c -Cyts SE37_11760和SE37_11830與多達(dá)28個不同的sRNA相互作用。由于幾乎所有鑒定的sRNA都在較低選擇壓力的基因間區(qū)域編碼，因此它們在不同的Geobacter物種中具有更大的突變空間。sRNA可參與調(diào)節(jié)不同Geobacter物種中EET基因的表達(dá)，需要進(jìn)一步研究以確定它們對基因表達(dá)的物種特異性調(diào)節(jié)的影響。
表2 差異表達(dá)的sRNA候選物
研究結(jié)論
本研究表明，G.soli是一種有潛力的Fe（III）氧化物還原劑和電流產(chǎn)生劑，其EET機理值得進(jìn)一步研究。在用不溶性電子受體和可溶性電子受體生長的G.soli細(xì)胞中鑒定到具有顯著差異豐度的蛋白質(zhì)集，可用于將來對該物種中EET機制的研究。sRNAs在Geobacter屬中調(diào)節(jié)EET基因表達(dá)的可能性為探索EET機制提供了新的理論基礎(chǔ)。
![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
