【材料】

1.  常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)儀器設(shè)備恒溫水浴振蕩器。
2.  培養(yǎng)液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）

【操作程序】

1.  細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上。
2.  培養(yǎng)液、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。
3.  二甲基亞砜（DMSO)在40℃冰箱中冷藏30min，備用。
4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。
5.  將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。
6.  用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7.  記錄復(fù)蘇日期

復(fù)蘇細(xì)胞的注意事項(xiàng)，這個(gè)真的很重要，一不小心就會(huì)造成小尷尬：

 1.  取細(xì)胞的過(guò)程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

 2.  凍存液的問(wèn)題：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對(duì)細(xì)胞不是完全無(wú)毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。

3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

4.  關(guān)于離心問(wèn)題大約為2種說(shuō)法：一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液；這種不需要離心，主要是怕離心不當(dāng)造成細(xì)胞損失嚴(yán)重；第二種說(shuō)法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體全倒凈，且一定倒干凈。按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇。

5.  細(xì)胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液，而在有些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。

6.  復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問(wèn)題：試驗(yàn)中復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過(guò)多，細(xì)胞濃度過(guò)低，不利于細(xì)胞的貼壁。

7.  加培養(yǎng)基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì)比較大，就會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)， DMSO的濃度在小于0.5%- 1％都是沒(méi)有問(wèn)題的。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度。