一般通過總量,純度與完整性三大項檢測來確認RNA質量:
1總量:微量分光光度計測260nm吸收值計算。
2純度:微量分光光度計測260nm/230nm吸收值的比值,用于評估有機溶劑殘留;260nm/280nm吸收值的比值,用于評估蛋白質污染比例。
3完整性:以Agilent Bioanalyzer進行毛細管電泳(capillary electrophoresis),并以軟件的RIN(RNA Integrity Number)分數評估,10為RNA完整性最好,0為最差。
RNA質檢參數中260、280、320、230nm下的吸光度分別代表了核酸、蛋白質、鹽濃度和有機溶劑的值。其中:
A230: 測定其它碳源物質,如酚,糖類等。
A260:核酸的吸收峰測,測RNA,DNA,引物等的濃度用的。
A280:蛋白質的吸收峰。
一般的,我們只看OD260/OD280(Ratio,R)在1.8~2.1范圍內時,我們認為 RNA中蛋白的污染是可以容忍的,不過要注意,當用 Tris 作為緩沖液檢測吸光度時,R 值可能會大于 2(一般應該是<2.2的)。當R 1.8時,溶液中蛋白的污染比較明顯,可以根據自己的需要決定這份RNA 的命運。當R > 2.2時,說明RNA已經水解成單核酸了,而純RNA的OD260/OD280的比值為2.0。
檢測RNA的完整性的方法:
完整的總RNA在進行變性凝膠電泳時會產生清晰的28S和18S rRNA條帶(真核樣品)。28S rRNA條帶的強度應當大致為18S rRNA條帶的兩倍。這種2:1的比率(28S:18S)是判斷RNA完整性的一個很好的指標。
使用變性凝膠電泳來評估RNA完整性的一個缺陷是觀察所需的RNA樣品量。通常情況下,需要在變性凝膠中上樣至少200 ng的RNA才能在EtBr染色下進行觀察。而在某些RNA制備實驗中,如從穿刺活檢樣品或激光捕獲顯微切割樣品中提取RNA,得率是非常低的。這種情況下,或許就不可能在進行表達譜分析實驗前取出200ng的RNA來評估其完整性。其它的核酸染料,比如Moleculor Probes (Eugene, OR) 的SYBR® Gold及SYBR Green II RNA染料,相比傳統的瓊脂糖凝膠電泳EtBr染色方法可以顯著提高靈敏度。通過使用300nm的透射光源(6 x 15瓦的燈泡)及特殊的濾光片,SYBR Gold RNA凝膠染色可以檢測到低至1ng的RNA,而SYBR Green II則可以檢測到2ng,從而可以使用更少的樣品來進行RNA完整性分析。
目前有一種快速簡單的方法可以替代傳統的凝膠分析方法,這種方法可以同時對RNA樣品進行定量及質量評估。Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)是第一款商業化的提供RNA樣品狀態細節信息的微流體儀器。當與RNA 6000 LabChip®(Caliper Technologies Corporation所擁有的一個注冊商標)結合使用時,每次進行分析最低僅需1µl濃度為10 ng/µl 的樣品。除了評估RNA完整性,這臺自動化系統同樣可以提供樣品RNA濃度及純度(如mRNA制備中的rRNA污染)的評估。在過去,檢測濃度及純度需要使用部分RNA樣品(通過A260分光光度法),而評估完整性則需要另外使用部分樣品。通過使用LabChip®系統,可以僅使用一份5ng的樣品來同時對濃度、完整性及純度進行分析。分析數據可以顯示為類凝膠圖像、電泳峰圖及表格形式等。