當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，就會使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費(fèi)。因此生根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程。最后要使生出的不定根濃密而粗壯。生根可采用1/2或者１／４MS培養(yǎng)基，全部去掉細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IBA等)。
   用下列方法誘導(dǎo)生根（1）將新梢基部浸入50或100ppm IBA溶液中處理4～8小時。（2）在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6天。（3）直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根。但前二種方法對新生根的生長發(fā)育更有利。而第三種對幼根的生長有抑制作用。因?yàn)楫?dāng)根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長發(fā)育。但這種方法比較可行。
    有時采用下列方法就可生根。（1）延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間。（2）有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量（即將增殖與生根合并為一步）。（3）切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，即沒有生根階段。第三種方法省去了一次培養(yǎng)基制作。切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理，但這往往適于一些容易生根的作物。
  少數(shù)植物生根比較困難的，需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營養(yǎng)等，從而誘發(fā)生根。
    從胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先即已分化的根，可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段。但因經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗數(shù)特別多，且個體較小，所以也常需要一個低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。
    試管內(nèi)生根壯苗的階段，目的是為了成功地移植到試管外的環(huán)境中，使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境因子。不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18～20^０Ｃ為宜。溫度過高牽涉到蒸騰加強(qiáng)。以及菌類易滋生等問題。溫度過低使幼苗生長遲緩，或不易成活．春季低溫時苗床可加設(shè)電熱線使基質(zhì)溫度略高于氣溫2～3^０Ｃ，這利于生根和促進(jìn)根系發(fā)達(dá)，有利于提前成活。
    光強(qiáng)應(yīng)比以前培養(yǎng)有所提高。以強(qiáng)度較高的漫射光為好，約4000Lx左右為宜，以維持光合作用所需光強(qiáng)。但光線過強(qiáng)刺激蒸騰加強(qiáng)，使水分平衡的矛盾更尖銳。