做了 5 年的 MTT 實(shí)驗(yàn) ，耗費(fèi)了上萬(wàn)塊 96 孔板。有成功的喜悅，有失敗的沮喪，有好多話(huà)要對(duì)各位實(shí)驗(yàn)同仁說(shuō)。在這之前，我們先回顧一下 MTT 的原理及操作步驟。

實(shí)驗(yàn)原理

       MTT 是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素 C 的作用下，生成藍(lán)色的 formazan 結(jié)晶。formazan 結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原，無(wú)法形成結(jié)晶），且該結(jié)晶溶解于 DMSO。利用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng) 490 nm 處的光密度 OD 值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 接種細(xì)胞：用含 10% 胎牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔合適的細(xì)胞數(shù)量接種到 96 孔板，每孔體積 180 ul。

2. 培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間。

3. 呈色：每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 緩沖液 pH=7.4 配制）20 ul。繼續(xù)孵育 4 小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞，需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加 150ul DMSO，振蕩 10 分鐘，使結(jié)晶物充分融解。

4. 比色：選擇 490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

個(gè)人心得體會(huì)

1. 細(xì)胞消化、接種數(shù)量：注意消化和數(shù)量，消化和數(shù)量，消化和數(shù)量（重要的事情說(shuō)三遍）。從我個(gè)人的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，這是重中之重。

若消化出現(xiàn)問(wèn)題，則會(huì)影響細(xì)胞的活性，進(jìn)而影響 OD 值。對(duì)于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的細(xì)胞，消化時(shí)胰蛋白酶中不添加 EDTA，消化時(shí)也僅需胰酶浸潤(rùn)數(shù)秒即可。

然而，對(duì)于 SW480 等一系列難以消化的細(xì)胞，胰蛋白酶中需添加濃度為 0.25% 的 EDTA。對(duì)于細(xì)胞接種數(shù)量要適宜，過(guò)小或過(guò)大均會(huì)影響 OD 值（過(guò)小細(xì)胞容易死亡，過(guò)大細(xì)胞容易生長(zhǎng)擁擠）。

我做過(guò)的幾種常見(jiàn)細(xì)胞的每孔接種數(shù)量如下（個(gè)人經(jīng)驗(yàn)）：

2. 培養(yǎng)液的棄去及 DMSO 溶解：一般大家喜歡用移液器吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，吸取的時(shí)候要注意移液頭要緊貼孔內(nèi)側(cè)壁吸取，不要觸碰底部的紫色結(jié)晶。我喜歡將 96 孔板倒扣于濾紙上來(lái)吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液。兩種方法效果差不多，大家根據(jù)個(gè)人喜好選擇。

加入 DMSO 溶解后，我喜歡將加入 DMSO 的 96 孔板放入 37 ℃ 孵箱內(nèi)孵育 10～20 min，這樣有助于 DMSO 對(duì)紫色結(jié)晶物的溶解（尤其在冬天）。

以下是我在去年 12 月的一些結(jié)果（某種藥物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，綠色為 control 組，紅色為加藥組）。下圖結(jié)果顯示，若不 37 ℃ 孵育，紫色結(jié)晶溶解不充分，造成 OD 值偏小（細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，control 組的 OD 值z(mì)ui佳范圍為 0.5-0.7）。

加入 DMSO 后，37 ℃ 孵育 15 min，振蕩 10 min。

無(wú)孵育，加入 DMSO 后振蕩 10 min。