我們將著重介紹 Strep-tag^? 在哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。

 

雖然大腸桿菌 E.coli 表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)濟實惠，但由于缺乏重要的脂類，分子螫合物，以及重要的翻譯后修飾，用它表達(dá)真核蛋白，可能會影響蛋白本身的折疊及功能，以膜蛋白為例，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能影響目標(biāo)蛋白在細(xì)胞膜的插入位置、及其應(yīng)有的功能^[1]。除此之外，當(dāng)目標(biāo)蛋白大于 50kDa 時，使用大腸桿菌系統(tǒng)可能表達(dá)出不完整的蛋白^[2]。

 

所以，為了研究特定蛋白的功能（如：信號通路）、生產(chǎn)較大型的蛋白，或進行高解析度的結(jié)構(gòu)分析，愈來愈多的實驗組選擇哺乳類表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)融合蛋白。其原因為哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)出的重組蛋白與人類蛋白十分相似，有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯后修飾^[3]。因此，愈來愈多科學(xué)家們更加關(guān)注于—如何從哺乳類細(xì)胞中的純化目標(biāo)蛋白。

 

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親和標(biāo)簽的選擇

 

首先，需考慮選擇合適的親和標(biāo)簽。常用于哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的親和標(biāo)簽有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag^? 等^[4-12]，整理于下表：

 

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這些親和標(biāo)簽在使用上各有千秋。

 

使用 His-tag 時，常遇到的問題是寄主蛋白與填料的非特異性結(jié)合，在哺乳動物重組蛋白的純化過程中，這樣的情況更為明顯。由于系統(tǒng)中有很多含有組氨酸（histidine）的殘基的蛋白，這種蛋白結(jié)構(gòu)與 his-tag 相似，容易與鎳柱結(jié)合，因此導(dǎo)致目標(biāo)蛋白純度降低^[13]。

 

FLAG-tag 系統(tǒng)可在非變性條件下進行純化，能得到高純度、有活性的蛋白，但其缺點為純化介質(zhì)較為不穩(wěn)定，且純化成本高上許多^[5]。

 

另一常用的標(biāo)簽為 GST-tag，一個 26kDa 的蛋白，其特點是表達(dá)量高，具高度抗原性，常用來增加目標(biāo)蛋白的溶解度，但常常會影響目標(biāo)蛋白的特性，一般推薦純化后將標(biāo)簽去除^[8]。

 

而 Strep-tag^?（包含 Strep-tag^?II或是 Twin-Strep-tag^?），都是短肽標(biāo)簽，分別為 8 或 28 個胺基酸，一般不干擾蛋白折疊或活性，因此適合用于蛋白功能性研究^[5]。Strep-tag^? 可以特異性的結(jié)合在 Strep-Tactin^? (二代介質(zhì)) 或 Strep-Tactin^?XT (三代介質(zhì)) 的生物素的結(jié)合位點。洗脫時使用的脫硫生物素（適用于二代）或生物素（三代），對同樣的結(jié)合位點有更高的親和力，能將目標(biāo)蛋白從同樣位置移除，因此得到的目標(biāo)蛋白純度一般高于 95%^[12]。

 

同時，三代 Strep-Tactin^?XT 與 Strep-tag^? 蛋白的親和力大幅提升，直接加入含目標(biāo)蛋白的哺乳細(xì)胞的培養(yǎng)上清，即可純化出所需蛋白（注: 原本使用二代需先以 Avidin 或是 BioLock 將培養(yǎng)基中的生物素遮蔽，才不會影響純化表現(xiàn)）。

 

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三代 Strep-Tactin^?XT 親和力顯著

 

圖 A 比較了 His-tag 與 Strep-tag^? 直接加入哺乳細(xì)胞培養(yǎng)上清的純化目標(biāo)蛋白的表現(xiàn)。

 

圖 A

 

圖 A：分別向 Strep-Tactin^?XT High Capacity 1ml 重力柱（左）和 Ni-NTA 1ml 重力柱（右）中，同時加入含 4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或 mCherry-His-tag (His) 螢光蛋白的 ExpiCHO 細(xì)胞培養(yǎng)上清（注: 接下來的實驗皆是取哺乳細(xì)胞表達(dá)某抗體后的上清，另加入高純度目標(biāo)蛋白進行實驗)。由圖可見，Strep-Tactin^?XT（左）能率的捕捉 mCherry-TST，而右方的 mCherry-His 幾乎無法掛柱。

 

此外，我們也測試了其他的蛋白，例如 SEAP (72 kDa) 或抗體 (mAb，其重鏈為 55 kDa)。圖 B 為以 Strep-Tactin^?XT 純化 SEAP-TST、mCherry-TST與 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析結(jié)果，可見對于不同蛋白，Strep-tag^? 系統(tǒng)都能純化出高純度的目標(biāo)蛋白。(注: 紅色標(biāo)記處為 mCherry 的降解產(chǎn)物，非雜帶)

 

圖 B

 

因 Strep-Tactin^?XT 與 Twin-Strep-tag 蛋白的高親和力，即使目標(biāo)蛋白的濃度低，使用 Strep-Tactin^?XT 仍可以有效的捕捉上清中的目標(biāo)蛋白。表 C 整理了幾個實驗的數(shù)據(jù)，顯示當(dāng)目標(biāo)蛋白濃度低于 20 μl/ml 時，得率仍能達(dá)到幾近 100%。

 

表 C

 

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Strep-Tactin^?XT 普適性高

 

除了上述實驗所用的 CHO 細(xì)胞株外（中國倉鼠卵巢細(xì)胞），另一常用于生產(chǎn)蛋白的哺乳動物細(xì)胞株為 HEK293(人胚胎腎細(xì)胞)，使用上較 CHO 簡單。我們測試了 Strep-Tactin^?XT 的純化表現(xiàn) : 表 D1 為以 Expi293 表達(dá) SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白后，目標(biāo)蛋白的濃度。圖 D2 為純化表現(xiàn)的 SDS-PAGE 分析。從中可知，與 ExpiCHO 培養(yǎng)基相同，直接將表達(dá)好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin^?XT 高載量重力柱中進行純化，一樣能夠快速的得到高純度的目標(biāo)蛋白。

 

表 D1

 

圖 D2

 

綜上所述，Strep-tag^? 非常適合用在哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)目標(biāo)蛋白，其純化過程也與常見的 ExpiCHO 及 Expi293 培養(yǎng)基相容，不須另外處理，讓實驗流程更為便利。加上 Strep-tag^? 系統(tǒng)在純度上的優(yōu)勢，是目前在這個應(yīng)用上的選擇。