隨著科學(xué)研究的深入，我們對(duì)樣品指標(biāo)的分析要求也越來越高，希望能夠在有限的樣品中獲取盡可能多的數(shù)據(jù)。多色流式就是一項(xiàng)為此量身定做的實(shí)用技術(shù)。但如何保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，在很大程度上取決于優(yōu)化的配色方案設(shè)計(jì)。

經(jīng)常會(huì)有初入流式分析的同學(xué)來問到，師兄，這個(gè)熒光強(qiáng)不強(qiáng)？這個(gè)通道能測出來不？是不是抗體不好使？為啥這個(gè)補(bǔ)償怎么也調(diào)不干凈？為啥（明明）感覺（應(yīng)該）陽性群不明顯（很明顯）等等問題。其實(shí)導(dǎo)致這些問題的原因有很多，可能來源于抗體、熒光素的選擇，樣本處理，上機(jī)操作，及后續(xù)的分析過程中。本期，讓我們結(jié)合流式分析儀的基本原理，來看看多色流式中熒光配色的方案及其原理。

01、首先了解：流式分析的基本步驟

一次完整的流式分析，通常可以概括為四步走，【樣本制備】→【染色標(biāo)記】→【上機(jī)操作】→【后續(xù)分析】。但是在成功地完成一次流式分析之前，我們還需要做大量的準(zhǔn)備工作，我們可以將之分為【實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)】、【預(yù)實(shí)驗(yàn)】。

行兵布陣講究的是謀定而后動(dòng)，同樣地，做流式分析時(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)也相當(dāng)重要。在這個(gè)環(huán)節(jié)，我們需要對(duì)消化方案、抗體標(biāo)記策略、熒光配色方案等等做初步規(guī)劃，并在預(yù)實(shí)驗(yàn)中逐步完善，最終在正式實(shí)驗(yàn)中獲得預(yù)期的數(shù)據(jù)結(jié)果。

本期，我們主要關(guān)注實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的熒光配色。但在正式討論熒光配色前，我們先來聊一聊流式分析儀的基本原理，相信這會(huì)對(duì)我們后續(xù)更好地運(yùn)用熒光配色有所幫助。

02、流式分析儀的基本原理

流式分析儀的識(shí)別過程可以簡單分為【光信號(hào)】→【電信號(hào)】→【數(shù)字信號(hào)】→【輸出】。具體過程如下：

流式細(xì)胞術(shù)原理圖

1.  光信號(hào)的接收識(shí)別

分析儀中的光路系統(tǒng)通過激光束照射流動(dòng)通過的單細(xì)胞懸液，產(chǎn)生不同的光信號(hào)，其中包括無需激發(fā)的物理參數(shù)信號(hào)（FSC、SSC）和需要一定能量的激光束激發(fā)的熒光信號(hào)。沒有照射到細(xì)胞的激光束，向前直射形成前向散射光信號(hào)（FSC），因此在一定范圍內(nèi)，F(xiàn)SC與細(xì)胞的大小正相關(guān)；接觸細(xì)胞的激光束，產(chǎn)生不同的折射光信號(hào)，包括側(cè)向散射光信號(hào)（SSC）、熒光信號(hào)。細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜程度越高，折射的SSC信號(hào)就越強(qiáng)，因此在一定范圍內(nèi)，SSC與細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜程度成正比。同時(shí)，由于SSC信號(hào)一般較弱，熒光信號(hào)通常能夠從折射光信號(hào)中分離出來，再經(jīng)過不同的濾光片分離，從而被特定的接收器（通道）接收。

2.  光信號(hào)的轉(zhuǎn)換輸出

接下來，光電二極管（用于FSC）、光電倍增管（用于SSC、熒光信號(hào)）會(huì)將【光信號(hào)】轉(zhuǎn)換成【電信號(hào)】，并最終轉(zhuǎn)換成【數(shù)字信號(hào)】在圖形界面【輸出】，到此我們就能夠直觀地看到我們所需要的流式圖了。

多色流式分析示例圖（小鼠肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞群中MO/MΦ/DC相關(guān)亞群的參考圈門策略）

因此，如何讓流式分析儀獲取足夠強(qiáng)度并且準(zhǔn)確的光信號(hào)，是獲得優(yōu)質(zhì)流式數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。在這里，有兩個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)：準(zhǔn)確性、強(qiáng)度，將成為我們?cè)O(shè)計(jì)熒光配色方案的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

03、熒光配色方案之準(zhǔn)確性指標(biāo)

準(zhǔn)確性：即如何讓熒光信號(hào)和諧共處、各自安好地被識(shí)別。一般在閱讀了大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上（新手上路的默認(rèn)必須操作，老司機(jī)也請(qǐng)注意行車規(guī)范），我們會(huì)確定在單一樣品中需要標(biāo)記的不同marker。主要分為以下幾個(gè)步驟：

1.  找到在流式分析儀上可識(shí)別的熒光素

通常我們會(huì)用不同熒光素標(biāo)記的抗體來結(jié)合marker，因此可用的熒光素有數(shù)量、種類上的限制。

1）  數(shù)量：受到分析儀接收器（通道）的限制，以BD LSRFortessa（以下簡稱Fortessa）為例，選配為5激光18通道，因此單管樣品染色的熒光素【數(shù)量】上限為18。

2）  種類：受到激光管波長、濾光片2個(gè)因素的限制。以BD FACSCalibur（以下簡稱Calibur）為例，選配為2激光（488nm、635nm）4通道。受到激光管波長的限制，以355nm、405nm激發(fā)的熒光素（BUV375、BV421等）并不能在Calibur上應(yīng)用；受到濾光片的限制， PerCP與PE-Cy7在Calibur上均為488nm激發(fā)，均被FL3（670LP）識(shí)別接收，不能同時(shí)適用。但在Fortessa上能夠二者能分別被488nm、561nm激發(fā)，分別被FL2（710/50nm）、FL7（780/60nm）識(shí)別接收，能夠同時(shí)適用。

2.  在可用的熒光素中，找出能夠和諧共處、各自安好的組合。

流式分析儀識(shí)別的熒光信號(hào)，一部分來源于激光激發(fā)細(xì)胞本身蛋白產(chǎn)生的熒光信號(hào)，我們稱之為“自發(fā)熒光”，另一部分來源于結(jié)合到細(xì)胞上的抗體耦聯(lián)的熒光素被激光激發(fā)后產(chǎn)生的信號(hào)。

在選用熒光素的時(shí)候，首先要盡量避開自發(fā)熒光的發(fā)射光譜范圍，避免自發(fā)熒光對(duì)目標(biāo)熒光信號(hào)的干擾。其次，我們要盡可能地基于“熒光素強(qiáng)度”、“相互干擾程度”兩方面和諧共處的原則來選用熒光素。

舉例：以5色標(biāo)記，F(xiàn)ortessa為例

組合1：PE、PE-eFluor610、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7

組合2：BV421、FITC、PE、PE-Cy7、APC

一般我們可能習(xí)慣于根據(jù)“熒光素強(qiáng)度”從高到低開始翻牌，但是對(duì)于多色流式而言，熒光素之間發(fā)射光譜的“相互干擾程度”非常關(guān)鍵，輕視它的后果就是會(huì)在補(bǔ)償調(diào)節(jié)的時(shí)候讓你調(diào)到懷疑人生。

組合1是一個(gè)極端配色方案（相信一般人不會(huì)想去挑戰(zhàn)這個(gè)補(bǔ)償調(diào)節(jié)），這是一組PE和PE耦聯(lián)熒光素的組合，在Fortessa上這個(gè)組合均由561nm激發(fā)，被范圍接近的濾光片分離，并被接收識(shí)別。雖然各自的“熒光素強(qiáng)度”足夠，但是由于在561nm 的激發(fā)下，它們的發(fā)生光譜有明顯的交叉重疊區(qū)域（如圖所示），即它們之間的“相互干擾程度”很高，這會(huì)讓補(bǔ)償調(diào)節(jié)變得相當(dāng)困難，進(jìn)而導(dǎo)致信號(hào)失真的可能性增大。這個(gè)時(shí)候，我們會(huì)選擇在可接受的范圍內(nèi)犧牲“熒光素強(qiáng)度”。例如選用熒光強(qiáng)度不那么強(qiáng)的FITC、APC-Cy7等來避開難以調(diào)節(jié)的補(bǔ)償參數(shù)，組合2就在一定程度上，兼顧了“熒光素強(qiáng)度”和“相互干擾程度”。

在561nm激發(fā)下，組合1的發(fā)射光譜分析

www.bdbiosciences.com/en-us/applications/research-applications/multicolor-flow-cytometry/product-selection-tools/spectrum-viewer

04、熒光配色方案之強(qiáng)度指標(biāo)

強(qiáng)度：即在滿足準(zhǔn)確性的熒光素組合內(nèi)，通過熒光素的分配，讓我們所有希望了解的marker，都能刷出存在感。在這里給大家2個(gè)經(jīng)驗(yàn)之談，大神勿噴。

1.  高低搭配，出圖不累。

我們可以將光信號(hào)強(qiáng)度理解為【marker豐度×熒光素強(qiáng)度】，因此對(duì)于低豐度的marker，我們要拉一把，配一個(gè)高強(qiáng)度的熒光素。例如，目標(biāo)細(xì)胞群體為小鼠來源的pDC（漿樣DC），部分marker為Siglec-HloF4/80mid，配色為PE（強(qiáng)）、APC-Cy7（弱），考慮的配色方案為，Siglec-H-PE、F4/80-APC-Cy7。此外，對(duì)于低豐度的marker，直接利用陽性群進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)可能會(huì)引起信號(hào)失真，因此可以考慮采用Compbead捕獲抗體或者采用高豐度marker搭配耦聯(lián)同樣熒光素的抗體進(jìn)行近似調(diào)節(jié)。

2.  同一層面，補(bǔ)償走開。

在多色流式分析的過程中，我們通常會(huì)設(shè)置多個(gè)邏輯層和門。在同一層次的邏輯設(shè)門中，可以考慮避開那些八字不合補(bǔ)償難以調(diào)節(jié)的熒光配對(duì)。例如，層次1（F4/80、Ly-6G）→層次2（CD11b、CD11c），配色為eFluor 450、PE-eFluor 610、FITC、PE。個(gè)人考慮的配色方案中，PE與PE-eFluor 610不放在同一邏輯層，采用F4/80-PE-eFluor 610，Ly-6G-eFluor 450，CD11b-FITC，CD11c-PE。如果有童鞋感興趣，可以嘗試把PE、PE-eFluor 610湊對(duì)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)存在對(duì)角線尖峰，若通過補(bǔ)償調(diào)節(jié)將尖峰調(diào)沒，可能會(huì)補(bǔ)償過度，從而導(dǎo)致一些細(xì)胞亞群的信號(hào)失真，得不償失。

05、總 結(jié)

熒光配色的目的，是為了讓流式分析儀能夠“準(zhǔn)確”地識(shí)別足夠“強(qiáng)度”的熒光信號(hào)。

▲ 從準(zhǔn)確性出發(fā)，我們要根據(jù)硬件限制（激光管、通道數(shù)、濾光片）選出可用熒光素，在可用熒光素中，根據(jù)“熒光素強(qiáng)度”、“相互干擾程度”、“自發(fā)熒光”等選出較優(yōu)的配色組合。

▲ 從強(qiáng)度出發(fā)，我們要讓每一個(gè)目標(biāo)marker都能獲得足夠被識(shí)別的熒光強(qiáng)度信號(hào)，因此要根據(jù)“高低搭配”、“邏輯設(shè)門”等來作出最終的熒光分配方案。