本公司專(zhuān)業(yè)經(jīng)銷(xiāo)代理進(jìn)口試劑，近日，我司實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常接到客戶(hù)這樣的疑問(wèn)，他們?cè)跍y(cè)試大腸桿菌轉(zhuǎn)化子時(shí)，大腸桿菌轉(zhuǎn)化子有大有小，結(jié)果詭異，想咨詢(xún)一下具體原因。

     這情況我遇到過(guò)，尤其菌液PCR時(shí)候，有的強(qiáng)有的弱，有的帶大小還不一樣。我沒(méi)有具體研究過(guò)啥愿意，但把大小一樣的那個(gè)送去測(cè)序，一般都是正確的。

關(guān)于你的這個(gè)情況，我分析【我自己的我也分析過(guò)】
1、可能酶產(chǎn)物碎了一些，這樣連進(jìn)去就有大有小。如果你引物用的是在載體上的，那很可能擴(kuò)出大小不同的。如果你引物就是在基因上的，這個(gè)好解決，你把退火溫度逐漸提高，看看是不是那個(gè)不同片段就沒(méi)了。
2、有的時(shí)候發(fā)生了片段自連【這個(gè)看起來(lái)好像很可笑，但其實(shí)我發(fā)現(xiàn)只要末端有一個(gè)堿基配對(duì)，時(shí)間長(zhǎng)的話(huà)，片段是可以連接到一起的，這個(gè)就跟TA連接實(shí)際一樣】。
3、你的電泳系統(tǒng)有污染，你把別人的片段給收進(jìn)去了，這個(gè)我確實(shí)證實(shí)過(guò)，我一批克隆40個(gè)基因，我曾經(jīng)在別的克隆中挑出過(guò)另外的基因。
4、另一種可能，你T載體上連接的方向問(wèn)題，如果酶切不徹底，可能同樣會(huì)造成不同大小片段，這些如果你量很多的話(huà)其實(shí)在跑電泳回收時(shí)候是分不開(kāi)的，但PCR趕巧了，也許就正好擴(kuò)出來(lái)了【這種情況只限于載體上有你用的酶切位點(diǎn)，而你目的片段上恰恰引入了這連個(gè)酶，這個(gè)你可以試著畫(huà)個(gè)圖看看，把TA連接的正反畫(huà)畫(huà)】。
5、DH好像能長(zhǎng)很大的，也沒(méi)關(guān)系的，我的有時(shí)候就很大點(diǎn)，其實(shí)不用放室溫，你冰箱4-8℃那層放置1個(gè)月，就看出來(lái)了。
6、所以我覺(jué)得這個(gè)問(wèn)題也沒(méi)法糾結(jié)了。如果你覺(jué)得切割實(shí)在很難，那干脆重新PCR從T載體上擴(kuò)出來(lái)【高保真擴(kuò)一般也不會(huì)突變，當(dāng)然TAKARA的primerstar除外】，帶上酶切位點(diǎn)，然后直接回收酶切連接就可以了，找到重組子后測(cè)序正確在表達(dá)就行了不是。