教你如何選擇最合適的載體----@遠慕新聞

2020-03-17 10:13 作者：洛辰來源：上海遠慕生物試劑

研究基因功能的生物醫學小白在課題最開始往往都是從構建一些必要的載體入手。那面對眼花繚亂的載體list（無論是Addgene還是公司）小白們更是無從下手。讀完本文，小白們會在一夜之間成為載體構建的“老司機”。

大體上來說，我們研究功能無非就是在體外（in vitro）和體內（in vivo）兩種實驗體系中對我們的目的基因功能加以描述，如圖1所示。

圖1 基因功能研究的兩種類型。
對于體外研究中的細胞系（或者原代細胞），我們更多會選擇轉染、慢病毒、逆轉錄病毒或者腺病毒；而對于體內研究，我們主要選擇購買遺傳修飾的動物模型，或者直接選用AAV介導的遺傳干預。
基因功能研究無非就是三種手段-①過表達、②敲低（減）表達、③敲除，剩余的就是檢測這三種干預手段對功能表型的定量和定性影響。下面我們分述在哺乳動物細胞實施這三種干預手段分別對應的載體選擇。

一、過表達
過表達的意思就是人為過量表達你的目的基因。這一類型的載體選擇主要關注一下兩點：
1、啟動子
對于哺乳動物細胞來說，常見載體的泛表達啟動子常見的基本就這幾個-CMV, SV40, EF1a, CAG。大部分都選擇CMV、CAG或者EF1a其中之一即可，SV40表達能力稍弱。但對于免疫細胞、干細胞我們推薦選擇EF1a即可。
比如圖2所示的載體是哺乳動物最常用的過表達載體。需要說明的是，對于其他模式生物的細胞，比如細菌、酵母、果蠅、線蟲、昆蟲、爪蟾等并不適用。

圖2 pCDNA3.1是哺乳動物中過表達最常用的商業化載體類型。其目的基因得分啟動子是CMV。

2、標簽
如果過表達是編碼蛋白的基因，通常我們會建議加個標簽（Epitope tag）。其目的是給過表達的目的基因做個特殊標記，從而有利于后續的檢測（你的過表達確定表達了么？表達量如何？）。
所以這種標簽通常體積較小，不會影響目的蛋白的構象、定位、功能等。比較常用的標簽有FLAG、HA、Myc、GFP等，我們一個基因通常只需選一種即可，不過有時候這些標簽需要多串聯幾個（比如，3′FLAG，3′HA，6′Myc等）一起增強檢測的靈敏度。我們不講標簽的區別，他們本質上都是一段可以編碼蛋白的基因片段。
載體構建的時候我們的目的基因跟這些標簽都是融合表達在一起的（通常標簽位于目的基因的下游，也叫做（基因的）3‘端，（蛋白的）C端）（圖3），后續我們只需要購買能特異性識別對應標簽的抗體做免疫印跡或者免疫熒光檢測即可。

圖3 實例：過表達基因下游帶有融合3′FLAG的載體
3、選擇標記
選擇標記（Selectable Markers）主要目的是區分表達于非表達目的基因的細胞。
常見的選擇標記有Puromycin、Blasticidin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin和各種熒光蛋白如ZsGreen、EGFP、RFP、mCherry等。
Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin是一類可以用對應的小分子藥物篩選的標記；熒光蛋白標記可以借助熒光顯微鏡直觀的觀察到表達目的基因的細胞，也可以直觀的估計感染效率等。
所以，原則是如果允許，Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin中的一種其中一個，比如puromycin（最常用），和熒光蛋白標記中的任選一個，比如ZsGreen（最常用）等。實例如圖4所示。

圖4 實例。此過表達載體帶有綠色熒光蛋白ZsGreen和Puromycin雙重標記。

二、敲低（減、降）表達
這類載體的選擇要簡單很多，啟動子選擇U6即可。但標記選擇通常跟過表達類似，盡量選Puromycin和ZsGreen，如圖5所示。

圖5 帶有ZsGreen和Blasticidin（BSD）雙重標記的敲減型載體。
三、敲除載體
目前最常用的就是CRISPR-Cas9的基因敲除載體，該系統是個二元結構，需要在同一個細胞中一起表達Cas9和針對目的基因的sgRNA。目前所用的載體有二合一的，也有分開兩個載體的。我們優先推薦二合一型載體。
此類型的載體也是U6啟動子驅動的載體，由于Cas9體積過大，通常這類二合一載體僅會帶有一個標記，如Puromycin或GFP，但也有人用同時帶有兩個標記的載體。如圖6所示。

圖6 基于CRISPR-Cas9的基因敲除載體。我們發現該載體帶有ZsGreen標記。同時Cas9C端融合FLAG標簽。

注意：

對于腺病毒載體，由于其感染效率極高，通常只需要帶熒光蛋白單個標記即可，但推薦編碼蛋白的目的基因過表達時帶常見標簽融合表達；
對于在體基因功能研究，我們常用AAV載體，這類載體我們往往只需要待單個熒光蛋白標記即可，但推薦編碼蛋白的目的基因過表達時帶常見標簽融合表達。

總結
繁雜的載體類型，我們只需要按照①過表達、②敲低（減）表達、③敲除分類，按照上述原則簡單選擇目的載體即可。即使我們看不太懂質粒圖譜也可以做出快速正確的選擇。

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