細胞培養實驗中不可或缺的除了培養基，胰酶也是非常重要的一個角色，雖然細胞培養試驗基本技術大同小異，每種細胞的培養條件各不相同，但是，在細胞傳代過程中都少不了這個步驟—胰酶消化。 

細胞消化使用胰酶時需要了解哪些問題？

一、 細胞培養過程中為什么要使用胰酶呢？胰酶的作用是什么？
胰酶是一種蛋白酶，酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上與培養皿壁結合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時，細胞由于自身內部細胞骨架的張力以及培養液表面張力可成為球形。

圖1.胰酶酶切位點

二、 使用胎牛血清培養細胞，在使用胰酶消化時發現血清可以終止此過程，這是何原因？

血清終止的原理其實是競爭抑制，就是用過量的牛血清中含有的蛋白和胰酶結合，使胰酶失去消化細胞蛋白的機會。

 
三、 為什么使用了胰蛋白酶消化，細胞還是成團的，這可能是什么原因導致的？

① 消化時間不夠 ② 吹打力度不夠 ③ 胰酶消化液濃度不夠 ④ 細胞密度過高之后才消化傳代 ⑤ 胰酶存儲不當，或者使用了過期胰酶

四、 胰酶分裝凍存時要注意什么？

胰酶分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并增大污染的可能性。

 
五、 怎么才能判斷胰酶消化完全？

注意：不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才表示消化好了。

一般肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙狀移動就可以了，就應該停止消化。

 
六、 胰酶適用于哪些細胞消化？它的消化效果與哪些有關呢？

胰酶適用于消化細胞間質較少的軟組織和傳代細胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶的消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關。

 
七、 胰酶中的酚紅有哪些作用？

酚紅在培養基中被用來作為pH指示劑，中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明：酚紅可以模擬固醇類激素（特別是雌激素）的作用。為避免固醇類反應，培養細胞尤其是哺乳類細胞時，建議用不含酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，在做流式細胞檢測時，也會使用不含酚紅的培養基或者胰酶。

圖 2. Phenol red test

 
八、 在做細胞凋亡檢測時，細胞為什么不能用含有EDTA的胰酶消化？

Annexin V（膜聯蛋白）是Ca2+依賴的蛋白，EDTA會螯合Ca2+從而影響Annexin V，進而影響結果，因此需選用不含EDTA的胰酶。建議放入培養箱中進行消化，時間可以長一點。隨時觀察細胞情況，避免消化過度；也可使用細胞刮刀將細胞刮下，后用槍吹勻，比消化簡單，還可避免使用胰酶帶來的傷害。