第1章 基因克隆

1. 操作流程

收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體

連接，取得連接產物 ——> 用感受態細胞做轉化 ——>接菌——>陽性克隆鑒

定(酶切法或PCR)——>質粒抽提——>質粒測序——>測序結果分析——>克隆

信息輸入數據庫——>質粒實物保存

2. 方法

2.1 設計引物

引物設計要求：引物長度為25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm

為70℃(±4℃)，且兩條引物的Tm 相差不超過4℃。引物之間及引物本身避免形成穩定的二聚體或發夾結構，引物與模板不能有任何錯配。

forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCC

reverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC

2.2 PCR

2.2.1 PCR 反應體系

模扳(100ng/ul 質粒) 2.00μl

4dNTP(10mM) 1.00μl

10×PCR Buffer 5.00μl

MgCl2(25mM) 5.00μl

5’Primer (10-12uM) 4.00μl

3’Primer (10-12uM) 4.00μl

5M 甜菜堿 10.00μl

Pfu (5U/ul) 0.50μl

ddH20 18.50μl

第1章 基因克隆

總計 50.00μl

2.2.2 PCR 反應程序

1)從cDNA 文庫克隆基因

Stage1 Stage2 Stage3

1 Cycle 30Cycle 1 Cycle

95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃

2min 30sec 30 sec

Xmin(2

min/Kb)

10min 1min

注：Pfu 酶zui適延伸溫度為68℃。

2)從含目的基因質粒中克隆

Stage1 Stage2 Stage3

1 Cycle 22Cycle 1 Cycle

95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃

2min 30sec 30 sec

Xmin(2

min/Kb)

10min 1min

2.3 割膠回收目的片段

(QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit)

1) 1%Agarose 膠電泳將目的DNA 片段用干凈的手術刀割下，放入1.5ml 離心管

2) 稱重后，在1.5ml 離心管中加入3 倍膠體積的buffer QG(100mg 加300ul)

3) 50℃水浴中放置10min(至膠完全溶解)，每2-3 分鐘混勻一次(溶膠液應于buffer QG 顏色相同)

4) 加入1 倍膠體積的異丙醇然后充分混勻，靜置片刻。

5) 將樣品轉移入柱子中(柱子的zui大容量為800uL)，然后13000rpm*1min 離心

6) 取下柱子，棄流出液，將柱子放回到剛才那個收集管中

第1章 基因克隆

7) 加入0.75mL buffer PE 至柱子，室溫放置2-5min，然后13000rpm*1min 離心

8) 取下柱子，棄流出液，再次13000rpm*1min 離心

9) 將柱子放置在一支新的1.5mL 離心管中，加入50uL EB buffer (或無菌H2O)至膜中央，靜置片刻，然后13000rpm*1min 離心，然后測定濃度

2.4 連 接

在連接反應中通常要求： (目的基因分子數：載體分子數=3：1)

連接反應體系

sample + -

10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl

PGEM-T (50ng/ul) 1.00μl 1.00μl 1.00μl

目的基因(150ng/ul) 1.00μl 1.00μl /

T4 連接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl

補水 6.50μl 6.50μl 7.50μl

于16℃連接過夜。或室溫(25℃)1 小時以上。

2.5 感受態細胞制備及轉化

2.5.1 CaCl2 制備感受態細胞(DH5α 、DH10B、0 )

1） 接過夜菌 在15ml 試管中加入3ml LB 培養基，從平板上挑取一單克隆接種，37℃，260rpm，培養過夜，約16 小時。

2） 接菌 取2ml 過夜菌接入200ml 新鮮的LB 培養基， 37℃，260rpm，培養，直至OD600=0.4-0.5(一般約2 小時),然后將菌液冰浴30-60 分鐘。

3） 收菌 4℃，5000rpm×5min，棄上清。

4） CaCl2 懸浮 若50ml 菌液收菌，用10ml 0.1M 的CaCl2 輕輕吹打，充分懸浮，冰浴10min。

5）離心 4℃，5000rpm×5min，棄上清。

第1章 基因克隆

6）CaCl2 懸浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 輕輕吹打，充分懸浮，冰浴30min 即感受態制備完成。

此時感受態可直接使用或冰浴過夜第二天使用或加入10%的滅菌甘油，混勻后-80℃凍存，以后使用(一般可存1 個月)。

注： 制備感受態細胞要求嚴格控制溫度，制備過程在冰上操作。

2.5.2 轉化(PGEM-T vector)

1) 準備1.5ml 的離心管，冰浴預冷。

2) 取100ul 感受態細胞，加入5ul 連接液，冰浴45-60min。

3) 42℃熱刺激90sec。(此關鍵步驟，一定注意溫度及時間)

4) 冰浴2min。

5) 加LB 培養基900ul，37℃，150rpm 培養45-60min。

6) 4000rpm×3min 離心。

7) 留100ul 上清，棄多余部分，混勻，涂布到含氨芐青霉素的LB 板(預先涂

布X-gal 和IPTG)。

8) 37℃ 培養箱倒置培養過夜，約16 小時。

2.6 接菌

1） 轉化得到藍白菌落篩選板 (因為我們一般用的是PGEM-T 做連接，經X-gal處理后，有插入片段的顯白色；載體自連的顯藍色，因此得到篩選。)

2） 挑取白色的菌落接到含氨芐青霉素的LB 培養基。

3） 37℃，260rpm 培養。

4） 培養5-6 小時后挑取2ul 菌液為模板做PCR 鑒定。

5） 以PCR 結果，將有目的片段插入的樣品以5ml LB 培養基再次接菌，37℃，260rpm 培養過夜，約16 小時。

2.7 陽性克隆鑒定 (PCR 鑒定)

2.7.1PCR 鑒定體系

第1章 基因克隆

10X Taq buffer 3 ul

4X dNTP (10mM) 0.5 ul

Taq DNA polymerase(5U/ul) 0.2ul(1U)

10uM引物 (雙向) 各1ul

50%DMSO(which is optional) 1ul

模板：過夜菌液 / 挑單克隆 2ul

加滅菌水至 30ul

2.7.2 PCR 鑒定程序：

94℃ 5min

94℃ 30s

30cycle 55℃ 30s

72℃ 3min

72℃ 10min

4℃ +∞

30ul 上樣，走電泳(以100bp plus marker 為對照)→核對片斷大小2.8 質粒抽提 (質粒小量抽提試劑盒)

1) 收菌 以10000 rpm ×1 min 離心收菌。(一般抽提一份用3-4ml 菌液)

2) 棄上清。

3) 加100ul 冰浴Solution I(含Rnase A)，渦旋振蕩，使菌體充分懸浮。

4) 加200ul Solution II，溫和混勻6 次。(此過程不超過5min)

5) 加280ul Solution III，溫和混勻6 次。

6) 以14000 rpm×10 min 離心。

7) 取上清，過吸附柱，以10000 rpm×1 min，棄濾液。

8) 吸附柱內加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，棄濾液。

9) 反復步驟8)一次。

第1章 基因克隆

10) 14000 rpm×1 min 離心。

11) 將吸附柱旋轉180 度后再14000 rpm×1 min 離心。

12) 加40ul 50℃預熱的ddH2O(或EB buffer)于吸附柱的膜中央，室溫靜置2min。

13) 14000 rpm×1 min 離心并收集洗脫液，即質粒DNA。

2.9 測 序

1) ABI377 測序儀測序。

2) 測序結果分析：用軟件Vector NTI Suite 6 分析測序結果。每個克隆相應的測序結果，分析結果，存儲信息分類輸入數據庫克隆信息管理系統。將測序完成的克隆編號入庫。

3. 基因克隆的編碼

根據實驗基因引物的號碼相對應編制。

如：基因引物編號： 1000_f 1000_r

克隆編號： 1000A1 or 100092

(注：號碼倒數第二位為日期編號： 1—9 為阿拉伯數字 10=A,11=B,12=C…zui后一位為克隆數編號，一般為1—3)