一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

    假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

    PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：

    ①模板核酸的制備。

    ②引物的質(zhì)量與特異性。

    ③酶的質(zhì)量及。

    ④PCR循環(huán)條件。

    尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

    模板：

    ①模板中含有雜蛋白質(zhì)。

    ②模板中含有Taq酶抑制劑。

    ③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白。

    ④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。

    ⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

    酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

    引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：

    ①選定一個好的引物合成單位。

    ②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

    ③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

    ④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

    Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

    反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul。或100 ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

    物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

    靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。

    假陽性

    出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

    引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

    靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：

    這種污染有兩種原因：

    一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。

    這種假陽性可用以下方法解決：

    ①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。

    ②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。

    ③必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

    二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

    出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

    PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。

    非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：

    ①必要時重新設(shè)計引物。

    ②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

    ③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

    ④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

    出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

    PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：

    ①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。

    ②減少dNTP的濃度。

    ③適當(dāng)降低Mg2+濃度。

    ④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。