實(shí)驗(yàn)介紹

(a) MTT

MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料?；罴?xì)胞在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素c的作用下四唑環(huán)開裂，生成藍(lán)色的甲月替結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，甲月替結(jié)晶的生成量僅僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶消失，不能還原MTT）。還原生成的甲月替結(jié)晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸鈉（PH 4.7）或10%酸化十二甲基磺酸鈉（PH 4.7）的溶液中溶解。利用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長處的光密度測(cè)出OD值，即反映活細(xì)胞數(shù)目。也可利用DMSO（二甲基亞砜）來溶解。用DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，一遍DMSO溶解甲月替顆粒，進(jìn)行比色測(cè)定。

1．取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶細(xì)胞的培養(yǎng)液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液），在37℃ 5％ CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3小時(shí)讓細(xì)胞帖壁（如果是懸浮細(xì)胞可直接進(jìn)行下一步）

2．用RPMI-1640培養(yǎng)液2～10倍遞次稀釋細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)情況2～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)孔。對(duì)照孔6個(gè)：3個(gè)陽性對(duì)照孔，每孔加0.1ml含大劑量細(xì)胞因子的RPMI-1640培養(yǎng)液，3個(gè)陰性對(duì)照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培養(yǎng)液。在37℃ 5％ CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)或預(yù)定的時(shí)間。

3．吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次（如為懸浮細(xì)胞，應(yīng)在吸去上清液前離心培養(yǎng)板）。

4．每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5％ CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6小時(shí)。

5．每孔加0.1ml酸化異丙醇，也可用含10％ SDS的10mmol/L HCl代替酸化異丙醇，在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產(chǎn)物充分溶解。置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定光密度（OD）值，檢測(cè)波長570nm，參考波長630nm。以O(shè)D值對(duì)樣品稀釋度作圖，比較標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品曲線即可求得待測(cè)樣品中細(xì)胞因子的含量。

(b) CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖（活力）：

CCK-8（cell-counting kit-8）檢測(cè)試劑盒是應(yīng)用WST-8取代MTT被還原，WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。且WST-8相較XTT和MTS化學(xué)性狀更穩(wěn)定， 因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)更加穩(wěn)定。此外，WST-8相較MTT、XTT，線性范圍相對(duì)寬，靈敏度更高。 

當(dāng)細(xì)胞增殖得越多越快，則formazan產(chǎn)生量越多，顏色越深；反之，當(dāng)內(nèi)外因造成的細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算便可以獲得細(xì)胞增殖（活性）相關(guān)數(shù)據(jù)。

(c) XTT：

化學(xué)名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲臢產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲臢產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

用XTT代替MTT可省去溶解還原產(chǎn)物結(jié)晶的步驟，XTT可以被活細(xì)胞中的代謝酶還原成黃色水溶性的代謝產(chǎn)物（formazan）。代謝產(chǎn)物在OD450處有吸收峰。

優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測(cè)快速；3、靈敏度高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。

缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。

應(yīng)用范圍：

生物活性因子的活性檢測(cè)；

大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選；

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；

藥物或基因?qū)е碌募?xì)胞毒性試驗(yàn)；

藥敏試驗(yàn)等。

服務(wù)周期：3周。