IHC 實驗從操作上來講并不算難，但是由于操作步驟較多，因此造成實驗結果不理想的因素較多，曾有人總結出「九九八十一難」，現在我們就 IHC 操作常遇到的一些問題及其解決方法進行匯總，希望能解決你的 IHC 問題。
1. 抗體濃度過高
一抗濃度過高是造成切片染色深常見的原因之一。解決辦法是在每次使用新抗體前對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，包括即用型的抗體也同樣需要進行測試，不能只簡單的按照說明書進行染色。

2. 抗體孵育時間過長或溫度較高
為了避免這種情況出現，相關人員應當嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的 1 小時，而是 30 分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。

3. DAB 變質和顯色時間太長
DAB 最好現用現配，如有沉渣，應進行過濾后再使用。配制好的 DAB 不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與 DAB 產生反應，從而降低 DAB 的效力；像未用完的 DAB 存放在冰箱里，需要的時候再取用的這種行為也是不可取的。DAB 的顯色最好在顯微鏡下監控，待達到理想的染色程度時，應立即終止反應。
當由于染色片太多或使用染色機，導致無法及時進行終止操作時，也應該盡量對新的，或使用頻率不高的抗體，進行顯色時的監控，避免顯色時間過長。

4. 組織變干
修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。這就要求相關人員在操作過程中要做到仔細認真，并采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周圍畫圈，達到有效的避免液體流失，提高操作速度的效果。

5. 切片在緩沖液或修復液中浸泡時間大于 24 小時
具體原理不清楚，但現象確實存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在 4oC 冰箱過夜，對結果無明顯影響；如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，則會出現背景著色。因此，不可存放時間太長。

6. 一抗變質、質量差的多克隆抗體
由于過期的抗體會導致切片不顯色或者背景著色，所以應當注意一抗的有效期。
用新買抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

7. 忘記血清封閉
在免疫組化中使用封閉血清，可以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準確性和降低背景。封閉血清一般選擇和二抗來源相同的，因此常用山羊血清。有時也會使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不可與一抗來源相同。

8. 操作過程中脫片
（1）可能是黏附載玻片質量的問題，建議嘗試更換載玻片。
（2）組織切的不好，可能是切片機刀片較鈍造成切片切的厚、不均勻，或者是切片機操作者手法不熟練等。
（3）可能是組織的問題，比如癌癥組織有壞死情況時，也容易造成脫片。
（4）烘烤結果不理想，可能是烘烤時間較短或溫度不夠等。
（5）操作時甩動幅度過猛，有脫片嫌疑的切片最好不甩或輕輕甩，可用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。
（6）修復過程出現問題，比如在抗原修復時，高壓時間過長，或者放進 100 度修復液時不夠平穩，也容易出現脫片的情況。此外，用 EDTA 修復比檸檬酸更容易脫片。

（7）一旦見到有組織漂起來，在操作時就要更加謹慎，使用 PBS 的時候盡量泡，不要沖。