如果一抗上直接加標記，不但不能保證抗體抗原反映的特異性，也不能保證實驗的可重復性。

    首先，由于抗體都是人工去設計的，對于一個人工設計的蛋白質來說，你可以設計一個很好的抗體與他結合；然而對于天然蛋白質，你不能保證一個很高的識別率和準確度。所以，針對1抗，我們可以設計出完美的2抗，然而針對原蛋白質，你無法設計一個特別完美的1抗。所以，直接標記1抗的出來的結果是不準確的，而標記2抗是相對于1抗直接標記來說更準確的，所以經過大量的實驗之后人們拋棄了直接標1抗的方法。當然，標2抗也不是完全完美的，當然你也可以標3抗，4抗，不過那個成本就指數上升了，在保證一定的置信度的情況下，人們一般標到2抗就夠了。

    其次，對于同一個抗原，不同來源的1抗所識別的位置可能會有很大差異。這樣，你就無法保證試驗的可重復性。而1抗作為抗原來講，可以將它的抗原決定簇設計的一樣，這樣針對不同的1抗，2抗是可以保證差不多一個樣子的。而且這也給節約成本和方便標記帶來了方便。

    所以一般現在都是2步標記，第一個原因是主要的，第二個原因是次要的。