WB磷酸化蛋白曝不出條帶的時(shí)候，會(huì)特別沮喪，特別希望有人指點(diǎn)一二。在"CST抗體技術(shù)交流群"里，大家隨時(shí)提問(wèn)，同行或CST技術(shù)團(tuán)隊(duì)會(huì)熱心解答。總結(jié)了下問(wèn)題類型，不難發(fā)現(xiàn)，磷酸化抗體的使用，仍是許多人關(guān)心的重點(diǎn)，今天我們單獨(dú)把它拎出來(lái)說(shuō)一說(shuō)吧。
 
    1.確定樣本中磷酸化蛋白的表達(dá)量

    ①對(duì)的樣本，②正確的處理方法和③合適的陽(yáng)性對(duì)照是實(shí)驗(yàn)成功的第一步。①實(shí)驗(yàn)前需先查閱文獻(xiàn)或通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該樣本是否表達(dá)，若該樣本根本就不表達(dá)目的蛋白，那就不要浪費(fèi)感情了吧；②若正常情況下樣本的磷酸化水平過(guò)低或不表達(dá)，可通過(guò)物理或化學(xué)方法進(jìn)行一定的刺激和誘導(dǎo)，刺激條件各不相同。但這并不代表刺激越多越好，充分但不過(guò)分（如磷酸化IRS1，僅需刺激5min，刺激過(guò)久會(huì)進(jìn)入負(fù)反饋機(jī)制進(jìn)而開(kāi)始降解）的正確刺激會(huì)幫助得到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果；③有合適的陽(yáng)性對(duì)照至關(guān)重要，在任何實(shí)驗(yàn)中，我們都應(yīng)考慮包含適當(dāng)?shù)年?yáng)性和陰性對(duì)照，可使您進(jìn)一步確定抗體檢測(cè)到的特異性信號(hào)。關(guān)于詳細(xì)的刺激方法和陽(yáng)性對(duì)照，可以參見(jiàn)CST官網(wǎng)。

    2.總蛋白和內(nèi)參對(duì)照都要做

    普通的內(nèi)參如Actin、GAPDH等和總蛋白抗體的對(duì)照都要做嗎？對(duì)，都要做！普通內(nèi)參可以作為體系的對(duì)照，保證上樣量一致從而排除體系本身的影響，對(duì)于結(jié)果分析比對(duì)十分重要。同時(shí)，總蛋白抗體也必不可少，僅僅是檢測(cè)到磷酸化蛋白表達(dá)量的增加并不能說(shuō)明問(wèn)題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值增加了才能說(shuō)明磷酸化水平增加，這種表述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方法是最客觀的，也是必需的。

    3.確保完全裂解并使用新鮮樣本

    相對(duì)于僅用裂解緩沖液裂解，裂解液裂解+超聲處理可確保整個(gè)細(xì)胞充分裂解并剪切染色質(zhì)DNA。建議在35%-40%的功率輸出條件下超聲3次，每次10s。由于不同儀器不同性能，請(qǐng)根據(jù)生產(chǎn)商的建議進(jìn)行優(yōu)化。超聲處理時(shí)應(yīng)保持低溫，冰上操作。如果您沒(méi)有探頭超聲儀，用細(xì)的注射器針頭反復(fù)吹打也能起到類似的作用。在得到樣品后，請(qǐng)不要反復(fù)凍融，建議-80℃冰箱分裝保存。

    4.小心蛋白殺手

    組織或細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)釋放出大量?jī)?nèi)源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，導(dǎo)致不同于正常生理狀態(tài)的差異。因此，在lysis buffer中加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，非常重要。否則條帶很淺不說(shuō)，結(jié)果可信度還不能保證。注意：PMSF#8553 要新鮮配置。

    5.樣品低溫處理

    除超聲時(shí)保持低溫，在做磷酸化蛋白的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都要保證低溫環(huán)境。磷酸化蛋白在室溫條件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制劑也很明顯。所以務(wù)必要保持！低溫！環(huán)境！

    6.用5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1h

    網(wǎng)絡(luò)上流傳的磷酸化抗體不適于用牛奶封閉的說(shuō)法是沒(méi)有科學(xué)依據(jù)的。這一誤區(qū)的出現(xiàn)可能是由于實(shí)驗(yàn)者使用了非實(shí)驗(yàn)級(jí)奶粉引起的（國(guó)內(nèi)許多奶粉含有磷酸酶等雜質(zhì)）。CST建議轉(zhuǎn)膜后迅速在TBS中洗滌膜幾秒，以便移除殘留的轉(zhuǎn)膜緩沖液，隨后使用5%脫脂牛奶（請(qǐng)使用實(shí)驗(yàn)級(jí)的#9999）的TBST室溫封閉1h，這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結(jié)合并降低背景。另外應(yīng)避免膜封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)檫@會(huì)掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。CST建議所有抗體均應(yīng)如此。CST科學(xué)家生產(chǎn)驗(yàn)證每一支上市的抗體的每一種應(yīng)用，顯然更懂得如何讓抗體表現(xiàn)出最佳的狀態(tài)。封閉完后，孵育一抗前最好在TBST中洗滌5min。

    7.一抗稀釋液

    請(qǐng)務(wù)必根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書中推薦的稀釋液稀釋一抗，不同產(chǎn)品有不同最佳稀釋液，采用CST推薦的一抗稀釋液并按標(biāo)準(zhǔn)protocol 操作實(shí)驗(yàn)，是您實(shí)驗(yàn)成功的保證。

    8.4℃條件過(guò)夜孵育一抗

    抗原抗體之間是一種非共價(jià)的結(jié)合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗體，這種物理吸附在高溫下會(huì)變?nèi)酰菀酌撀洌虼耍紫缺ＷC4℃抗體孵育條件非常重要。其次要保證抗原和抗體相互磨合孵育的時(shí)間，磷酸化蛋白只占總量的極少部分，過(guò)夜可保證充分結(jié)合進(jìn)而曝出更漂亮的條帶。哪怕不是磷酸化蛋白，CST也推薦4℃過(guò)夜孵育，讓結(jié)果呈現(xiàn)最好的一面。

    9.洗膜條件

    一抗和二抗均建議用1*TBST （相對(duì)于PBST緩沖液，最終信號(hào)會(huì)更強(qiáng)）洗膜3次，每次5min。洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)減弱（抗體從結(jié)合的位點(diǎn)脫落），過(guò)短則會(huì)導(dǎo)致背景深。另外，洗膜的時(shí)候，盒子要比膜稍微大一圈，保證膜充分的在洗滌液中晃動(dòng)，且建議單張洗膜而非幾張一起清洗。

    10.二抗室溫1h孵育

    用5%牛奶的1*TBST稀釋的二抗（BSA稀釋二抗會(huì)產(chǎn)生較高背景），室溫1h孵育即可。

    11.掌控好曝光或壓片時(shí)間

    磷酸化蛋白檢測(cè)除了容易有雜帶外，還容易出現(xiàn)高背景。所以曝光或壓片的時(shí)候注意掌控好時(shí)間，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使得背景深，過(guò)短又會(huì)不容易曝出條帶或曝出條帶很淺，所以需要優(yōu)化出適合自己靶蛋白和實(shí)驗(yàn)體系的最佳曝光時(shí)間。

    12.磷酸化和總蛋白抗體到底怎么孵育？

    一般磷酸化和總蛋白的條帶位置基本是一樣的，所以如果樣品比較珍貴或有限的情況下，可以在壓完磷酸化抗體后，將膜strip后再壓總蛋白抗體，stripping的時(shí)候注意溫度盡量控制在50℃以內(nèi)。不過(guò)CST的做法是建議在樣品充足的情況下同時(shí)跑兩塊膠，比strip效果會(huì)更好。

    13.蛋白Marker很重要！

    做磷酸化蛋白WB時(shí)，除了目的蛋白的條帶外，還可能會(huì)出現(xiàn)一些非特異性條帶。所以在此情況下，請(qǐng)一定要根據(jù)marker大小進(jìn)行比對(duì)，查看條帶的分子量。否則有可能會(huì)誤以為一些非特異條帶是自己想要的，分析半天走了冤枉路不說(shuō)，還耗費(fèi)了大量精力。

    最最重要的，是抗體質(zhì)量要好！

    磷酸化抗體，當(dāng)然選擇CST。

    抗體具體使用條件，請(qǐng)嚴(yán)格遵照抗體說(shuō)明書，這都是生產(chǎn)和驗(yàn)證抗體的科學(xué)家經(jīng)過(guò)很多摸索，優(yōu)化出來(lái)的最佳條件。