放大蛋白生產(chǎn)可不僅僅是將細(xì)胞培養(yǎng)瓶的數(shù)量增加一倍。無論你是打算將你的基礎(chǔ)研究提升一個(gè)檔次，還是準(zhǔn)備開展動(dòng)物研究或I期臨床試驗(yàn)，你都需要更加嚴(yán)肅認(rèn)真地對(duì)待蛋白生產(chǎn)。

隨著項(xiàng)目越來越大，高效利用時(shí)間和經(jīng)費(fèi)就顯得更加重要。選擇最有效的方式來進(jìn)行這一切，從細(xì)胞培養(yǎng)到收集和純化終產(chǎn)物，絕對(duì)物有所值。那么，現(xiàn)在就讓我們與“馬馬虎虎”告別，擁抱優(yōu)化的蛋白生產(chǎn)吧。

貼壁細(xì)胞

Fred Schendel領(lǐng)導(dǎo)了明尼蘇達(dá)大學(xué)生物技術(shù)資源中心（BRC）的大規(guī)模蛋白純化工作。他認(rèn)為：“在研究中，一切都在變小、變小。新技術(shù)的出現(xiàn)，讓你不再需要大量蛋白去做基礎(chǔ)研究。”Schendel表示，由于成本高，需求低，BRC已經(jīng)淘汰了哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備。不過，對(duì)于那些需要幾百毫克蛋白的實(shí)驗(yàn)室而言，還是有很多方法能提高產(chǎn)量。比如，Schendel建議的外包。

那么，在實(shí)驗(yàn)室中你該如何放大？許多實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣使用多孔板、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶來培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。換成更大的容器似乎很簡單，或者嘗試一下多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶，或者將它們相互連接和堆疊

有時(shí)，對(duì)蛋白的需求可能超出了實(shí)驗(yàn)室的能力。那么，一種選擇就是購買更多的培養(yǎng)箱，或擴(kuò)展到滾瓶或其他系統(tǒng)，當(dāng)然這需要投入資金和人員。在Sanford-Burnham醫(yī)學(xué)研究所，“他們大多數(shù)時(shí)間都嘗試懸浮培養(yǎng)，因?yàn)檫@更容易放大，”主管Darrin Kuystermans談道。有時(shí)，這也意味著他們要改造細(xì)胞系來生產(chǎn)感興趣的蛋白。不得已，他們也會(huì)使用微載體，通過懸浮培養(yǎng)的方式來培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。
內(nèi)還是外？

另一種促進(jìn)蛋白生產(chǎn)的方式是讓蛋白分泌到培養(yǎng)基中，這樣下游處理就沒那么困難。“我們只需要從培養(yǎng)基中純化它，而不需要裂解細(xì)胞，并在蛋白純化的過程中處理其他所有蛋白，”Kuystermans解釋道。

偶爾，細(xì)胞也沒那么聽話。即使有了信號(hào)肽，它也不分泌蛋白。在這種情況下，Kuystermans可能改造純化標(biāo)簽，以便更容易地從細(xì)胞裂解液中捕獲蛋白。

Kuystermans建議先在小的搖瓶系統(tǒng)中檢驗(yàn)，而不是一開始就采用較大規(guī)模的系統(tǒng)。攪拌引入了額外的氧氣，會(huì)引起剪切并形成其他壓力，這可能導(dǎo)致細(xì)胞開始結(jié)塊，或不再生長。對(duì)于那些有疑問的細(xì)胞或蛋白，你可以試試瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，而不要花幾個(gè)月的時(shí)間來篩選穩(wěn)定的細(xì)胞株，然后才發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)有問題。

不斷優(yōu)化

當(dāng)你知道表達(dá)系統(tǒng)沒問題時(shí)，下一步就是優(yōu)化表達(dá)條件。最重要的培養(yǎng)參數(shù)包括溫度、溶氧（DO）、pH和葡萄糖，這些可利用探頭和傳感器來監(jiān)控，通過手動(dòng)或自動(dòng)控制。一種優(yōu)化方式是利用“微型反應(yīng)器”系統(tǒng)，比如Applikon Biotechnology的micro-Matrix或m2p-labs的BioLector，也可以利用一組搖瓶。

當(dāng)然，這一切并非線性放大。例如，開發(fā)工作往往是分批培養(yǎng)，而生產(chǎn)是以更高密度的灌注模式開展的，利用中空纖維反應(yīng)器。在這種情況下，一些培養(yǎng)的特征是不同的，意味著結(jié)果也可能不同。同樣地，液體表面體積比往往也不能直接放大，這會(huì)影響DO和CO2，從而影響pH水平。

優(yōu)化下游（收集和純化）過程同樣重要。你需要篩選填料，以便實(shí)現(xiàn)最佳的分離效果。其他考慮因素包括填料在分離條件下的穩(wěn)定性，樹脂的剛性和柱尺寸。據(jù)Kuystermans介紹，為了確保放大過程中目標(biāo)蛋白在柱中的停留時(shí)間恒定，柱的直徑可以增加，但柱床的高度應(yīng)保持不變。

盡情搖擺

懸浮培養(yǎng)物的放大可以在可重復(fù)使用的生物反應(yīng)器中進(jìn)行，Kuystermans稱之為“clean and play”的系統(tǒng)。這主要指的是攪拌瓶或罐，能夠監(jiān)測和控制各種參數(shù)。