樣品制備原則

    樣品制備是雙向電泳中最關鍵的一步，將直接影響2-DE結果好壞。目前并沒有一個通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個基本的原則：1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質的損失；2）減少對蛋白質的人為修飾；3）破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質處于完全變性狀態。

    根據這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑，如CHAPS與Zwittergent系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducing agents），最常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。當然，也可以選擇性的加入Tris-base,蛋白酶抑制劑以及核酸酶。

    樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合，以達到對樣品蛋白的最大抽提。在對樣品蛋白質提取的過程中，必須考慮到去除影響蛋白質可溶性和2DE重復性的物質，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會降低等電聚焦的電壓，甚至會損壞IPG膠條，這樣都會造成2-DE的失敗。樣品制備的失敗很難通過后續工作的完善或改進獲得補償。

    核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應控制好條件，并防止產生泡沫；而加入的外源核酸酶則會出現在最終的2D膠上。脂類和多糖都可以通過超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時間太長；也可以采取凝膠過濾或沉淀/重懸法脫鹽，但會造成蛋白質的部分損失。

    因此，樣品制備方法必須根據不同的樣品、所處的狀態以及實驗目的和要求來進行選擇。目前有很多方法適于2-DE，如組織或細胞的總蛋白提取物、亞細胞組份或細胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、采用親合純化凝集素結合蛋白等）。

    一、細胞樣品

    1. 細胞培養，加藥與處理。

    2. 胰酶消化貼壁細胞，PBS漂洗3次(1500ｇ，5min)，棄上清, 再次離心，去盡殘液（非常重要?。Ｈ缫容^細胞膜蛋白組的差別，最好用細胞刮收獲細胞。如用10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替PBS，可有效降低樣品的鹽濃度。

    加入5倍體積裂解液，混勻（或將1×106細胞懸于60～100?l裂解液中）。

    3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml Dnase，在4℃放置15分鐘。

    4. 15,000轉，4℃離心60分鐘（或40,000轉，4℃離心30分鐘）。

    5. 收集上清。

    6. 測定蛋白濃度(采用BioRad RC/DC protein assay kit)。

    7. 分裝樣品，凍存于－70℃。

    二、組織樣品

    1. 碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。

    2. 將適量粉末狀組織轉移至勻漿器，加入適量裂解液，進行勻漿。

    3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分鐘。

    4. 15,000轉，4℃離心60分鐘（或40,000轉，4℃離心30分鐘）。

    5. 收集上清，測定蛋白濃度。

    6. 分裝樣品，凍存于－70℃。

    注意事項：

    1. 8 mmol/L PMSF必須在添加還原劑之前用，否則PMSF會失去活性。

    2. 40 mmol/L濃度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。

    3. 細胞清洗――大多用PBS，若PBS殘留于細胞表面會造成膠上出現水平條紋，則可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此問題。

    雙向電泳操作步驟

    水化上樣(被動上樣)

    1. 從冰箱中取出IPG膠條，室溫放置10min。

    2. 沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各1cm左右不加樣，中間的樣品液一定要連貫.注意：不要產生氣泡，否則會影響膠條中蛋白質的分布。

    3. 用鑷子輕輕撕去IPG膠條上的保護層。注意：堿性端較脆弱，應小心操作。

    4. 將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上.注意:不要將樣品溶液弄到膠條背面,因為這些溶液不會被膠條吸收;還使膠條下面的溶液產生氣泡。如產生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕走。

    5. 放置30~45min大部分樣品被膠條吸收，沿著膠條緩慢加入礦物油，每根膠條約3ml(17cm IPG)，防止膠條水化過程中液體蒸發。

    6. 置等電聚焦儀于-20℃水化11~15h。

    第一向 等電聚焦

    1. 將紙電極置于聚焦盤的正負極上，加ddH2O 5~8?l潤濕。

    2. 取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干，膠面朝下，將其置于剛好潤濕的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。

    3. 將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤中，膠條的正極（標有+）對應于聚焦盤的正極，確保膠條與電極緊密接觸。

    4. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油。

    5. 對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。

    6. 聚焦結束的膠條，立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳。或將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存，電泳前取出膠條，室溫放置10分鐘，使其溶解。

    第二向SDS-PAGE電泳：

    1. 配制12%的丙烯酰胺凝膠。

    2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。

    3. 配制膠條平衡緩沖液I

    4. 在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品，這樣可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。

    5. 將膠條轉移至樣品水化盤中，加入6ml(17cm IPG)平衡緩沖液I，在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

    6. 配制膠條平衡緩沖液II。

    7. 第一次平衡結束后，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體，放入平衡緩沖液II中，繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

    8. 用濾紙吸去SDS-PAGE膠上方玻璃板間多余的液體，將二向凝膠放在桌面上，凝膠的頂部面對自己。

    9. 將瓊脂糖封膠液加熱溶解。

    10. 在100ml量筒中加入TGS電泳緩沖液。

    11. 第二次平衡結束后，取出膠條，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。

    12. 用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中漂洗數次。

    13. 將膠條背面朝向玻璃板，輕輕放在長玻板上，加入低熔點瓊脂糖封膠液。

    14. 用適當厚度的膠片,輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸.注意:不要在膠條下方產生氣泡，應推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。

    15. 放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液凝固。

    16. 打開二向電泳制冷儀，調溫度為15℃。

    17. 將凝膠轉移至電泳槽中，加入電泳緩沖液，接通電源，起始時用的低電流（5mA~10mA/gel/17cm），待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（20-30mA/gel/17cm）待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。

    18. 電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。

    19. 進行染色。

    雙向電泳蛋白點的切取和保存：

    1. 用PDQuest軟件或肉眼比對，找出感興趣的蛋白點，并做好標記和記錄。

    2. 用MilliQ水沖洗膠2次。

    3. 用色譜純甲醇和MilliQ水沖洗Ep管

    4. 將槍頭(200?l)下端剪去，使其內徑略小于蛋白斑點的直徑，用色譜純甲醇和MilliQ水沖洗槍頭。

    5. 對準斑點中央小心將蛋白切割下來，放入Ep管，MilliQ水漂洗2次，如膠塊太大，將其切成1 x 1 mm的膠片。

    6. 將切好的點做好標記和記錄，置-80oC保存或凍干后-20oC存放。

    注意事項：

    1. 盡量避免皮膚和頭發的角蛋白的污染，在操作過程中應戴一次性的PE手套（不用乳膠手套）和帽子。

    2. 不要將膠長期存放于乙酸溶液中。

    3. Ep管及染膠的容器必須用甲醇和水充分清洗，尤其應與進行Western blotting的容器分開，以避免casein或BSA的污染。