底物顯色是最后一步，也是最有文章可做的一步。顯色的標記方式有生物素標記、地高辛標記、各種酶標記等等，酶標的底物又有各種生色底物、化學發光法底物和熒光底物可供選擇，顯色方法多種多樣，下面我們針對常用的幾類方法進行總結對比分析，供大家方便在以后實驗中根據自己需求進行選擇。

酶促反應較生物素安全且反應快速，是WB 中的主流顯色方法。酶促反應根據不同底物顯色方法又包括化學發光和底物顯色。化學發光法靈敏度高，可以達到pg級，而底物顯色由于直接顯色而操作簡單且成本低。最為大家所熟悉的底物顯色當數HRP（辣根過氧化物酶，Horseradish Peroxidase ）和AP（堿性磷酸酶，Alkaline Phosphatase ）。

HRP

這是最常見的酶促發光或顯色的交聯酶，由于HRP 比活高、分子量小、特異性強、穩定性好和作用底物范圍廣的優點而得到廣泛使用。HRP的底物主要包括化學發光底物和生色底物兩大類，對于底物的選擇，主要考慮的是靈敏度、背景和使用的方便性和穩定性。

1 生色底物

生色底物顯色主要是利用底物在有HRP 和H2O2的存在下失去電子而呈現出顏色變化積累這一過程檢測WB 的結果。生色底物主要包括DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等。表1對這4種生色底物從不同方面進行比較。其中，DAB應該是最熟悉的底物，靈敏度高，特異性好，缺點就是需要現配現用，顯色后光照數小時會褪色，不能永久保存，而且有毒。4-CN反差大容易拍照，可與DAB聯用。TMB的信噪比高，成分安全，特別合適于靈敏度要求高的WB，但是也要避免由于靈敏度高而引起的高背景，因此可以相應的延長封閉的時間和注意洗滌的次數。AEC各方面性質與DAB相似，但靈敏度要差一點。



2 化學發光底物

化學發光底物最常用的是魯米諾（Luminol ），化學發光法由于僅在酶和底物都存在的時候才會發光，不同于生色反應，所以特別適合在同一張膜上對不同的目標蛋白分別進行多次檢測。目前最高檢測靈敏度已經達到低飛克（Femto）級別，成為安全且靈敏度最高的WB檢測方法。

ECL 在許多研究人員心目中的幾乎成為化學發光法的代名詞，也是文章的保證之一。一般含有魯米諾、H2O2和發光增強劑等物質。發光試劑中的魯米諾被HRP 和H2O2氧化，產生熒光，這個過程被發光增強劑加強。其中，增強劑在體系中扮演著核心角色，決定著ECL 化學發光的發展。化學發光的常見問題主要是抗體濃度過高，所以抗體用量要比規定的稀釋倍數放大，確保不會因為HRP過量導致底物過快消耗完而引起結果不穩定。

AP

AP 作為一種經典常用的顯色交聯酶，自有其優點，如AP的底物顯然更穩定。AP顯色的靈敏度已經可以達到低pg級，但前提是封閉要做得好。常用的AP包括BCIP（5- 溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽）、NBT（四唑硝基藍）和INT （硝基四紫唑），以及它們之間的組合使用，如表2。



這其中，BCIP/NBT是堿性磷酸酶最佳的底物組合之一，其靈敏度最高，顯色比較銳利，成像性也比較好，因此最常被用到。

各種顯色方法均有其優缺點和適用范圍，上面這些介紹讓大家對各種產品的優點缺點一覽無遺，希望這些內容可以給大家帶來幫助，早日成為一個WB 高手。當然，還要提醒大家，注意操作時佩戴手套，部分顯色試劑有毒性，避免與皮膚直接接觸，記得用后及時徹底沖洗。