質(zhì)粒是基因工程中常用的載體，也是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本要素，正確的閱讀質(zhì)粒圖譜是實(shí)驗(yàn)的第一步，對(duì)于實(shí)驗(yàn)小白，本文教你如何快速破譯質(zhì)粒圖譜。

首先，熟悉你所感興趣的質(zhì)粒

讓我們從一個(gè)經(jīng)典的質(zhì)粒pBR322開始，由于它具有成功克隆所需要的所有特性，因此常被用作衍生載體的主干。從圖譜中心可以看到，線性化質(zhì)粒的大小為4361個(gè)堿基對(duì)。在開始處理任何質(zhì)粒之前，建議使用一種獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶將其線性化，以檢查大小是否與預(yù)期大致相同。

黑色箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向，這是克隆所必需的。如果你在另一個(gè)基因的中間克隆了你的目的基因，請(qǐng)確保這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄方向相同。否則，本地啟動(dòng)子會(huì)干擾你的基因表達(dá)。

“Ori”是什么意思?

在諸如Entrez-PubMed這樣的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，質(zhì)粒序列以線性序列的形式從ori序列開始繪制。“Ori”指質(zhì)粒復(fù)制的起點(diǎn)，不能改變它，一旦質(zhì)粒不能復(fù)制，則是無(wú)用的。

關(guān)于ori要記住的另一件事是，同源質(zhì)粒常常是不相容的。這意味著你將無(wú)法在一個(gè)細(xì)胞中維持兩個(gè)pBR323衍生的載體，即使它們具有不同的抗生素耐藥性基因。pBR322 ori也被用于pUC18，真核生物載體中第二常見的主干。

限制性位點(diǎn)在哪里找？

相應(yīng)酶的限制性位點(diǎn)用起始核苷酸位置的垂直線表示。這些位置應(yīng)該是唯1的，但值得一查，因?yàn)檠苌d體通常包含額外的被遺忘的序列。

關(guān)于抗生素抗性基因

pBR322有兩種抗性基因：tet(四環(huán)素耐藥)和amp(氨芐青霉素耐藥)。這些基因分別編碼一個(gè)外排泵(tetR)和β-內(nèi)酰胺酶(ampR)從細(xì)胞中排泄四環(huán)素和氨芐青霉素。Tet和amp從不同的方向閱讀。

記住，β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素類抗生素的解毒沒有特異性。所以即使你有兩個(gè)不同復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，如果一個(gè)表達(dá)了甲氧西林耐藥基因另一個(gè)表達(dá)了氨芐青霉素抗性基因，你也不能同時(shí)選擇兩個(gè)質(zhì)粒。

當(dāng)使用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)將目的基因克隆到質(zhì)粒時(shí)，要注意哪些位點(diǎn)屬于你的抗生素抗性基因。例如，BamHI在TetR的中間酶切。我們都知道，基因的破壞會(huì)導(dǎo)致基因功能的失活——在這種情況下，就是抗生素耐藥性。

復(fù)制如何開始和停止?

質(zhì)粒除了基因外，通常還包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子來(lái)自E.coli噬菌體。噬菌體SP6和T7的啟動(dòng)子常用于體外RNA擴(kuò)增。它們需要噬菌體聚合酶，因此在體內(nèi)不活躍。

下圖為爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)載體pTLNX的表達(dá)圖譜。除了常見的pBR322?ori和抗生素耐藥基因AmpR和CmR(氯霉素耐藥)外，還存在SP6和lacUV啟動(dòng)子。在SP6啟動(dòng)子下游，rrnBT2終止子允許克隆到多克隆位點(diǎn)的基因有效終止。
pTLNX載體還具有質(zhì)粒選擇基因(ccdB)，以及病毒SV40核定位信號(hào)和Xenopus globine 3 ' UTR，允許克隆基因的高表達(dá)。

質(zhì)粒圖譜總是在進(jìn)化，最好使用已知的圖譜資源庫(kù)，如Addgene、Entrez-PubMed等，以免忽略一些“不重要”的特性，而這些特性對(duì)您的實(shí)驗(yàn)可能是至關(guān)重要