是不是在質粒提取過程中總會碰到提取的質粒濃度不夠或者純度不夠的情況？

其實經常提質粒之后，會發現提質粒是一項非常簡單且基本的實驗操作。但如果真問起一些質粒提取的一些細節，可能很多人回答不了。不信隨我看看。

首先，質粒的提取可分為質粒小提、質粒中提、質粒大提。目前大多數實驗室都選用試劑盒方法來提取質粒，可以根據不同的實驗需求，來選擇相應的試劑盒。

質粒小提主要是對于1ml-5ml的大腸桿菌菌液中質粒DNA進行小量提取，獲得的質粒用來進行常規的載體構建實驗。

而質粒中提，是在質粒小提的基礎上進一步去除菌液中的內毒素，獲得的質粒可以用于細胞轉染，常規需要菌液量為10-15ml。

質粒大提與中提方法相同，一次可對100ml-200ml菌液進行抽提，從而獲得大量質粒。

10大問題，幫您解決在質粒提取過程中遇到的最基本的困惑

1.質粒制備的基本原理是什么？

在分子生物學實驗中，大多數人都做過質粒提取，但并不是所有的人都知道質粒制備的基本原則。

堿裂解法是提取質粒最常用的方法。

質粒先是被轉化到大腸桿菌中，然后挑選單菌落接種到含有特定抗生素的培養基中，當培養的大腸桿菌達到生產的平臺期時（一般為12到16個小時），通過高速離心開始收集大腸桿菌；使用試劑盒的懸浮液把菌體全部重懸并用SDS-NaOH進行裂解。

因為SDS是一種很強的去污劑，可以把細胞膜中的蛋白質和磷脂抽提出來，從而使細胞內的物質得到釋放，而NaOH是強堿，可以讓蛋白質、染色體DNA和質粒DNA進行變性；當菌體徹底裂解了以后，再加入酸性醋酸鉀,用來中和堿性裂解液，同時變性蛋白質、變性基因組DNA和細胞碎片形成沉淀，但是在上清溶液中，存在正確復性的質粒DNA，通過離心，可以收集上清溶液。最后通過試劑盒的核酸吸附材料，來對上清液中的質粒DNA進行回收。

2.質粒DNA制備的關鍵是什么？

使用堿裂解法制備質粒的關鍵是把握好SDS-NaOH處理菌體的時間。

如果質粒長時間處于堿性環境，就有可能出現不可逆的變性反應，使得最終提取出來的質粒中含有變性質粒。這些變性質粒，由于不能進行酶切反應，所以無法進行實驗。

3.質粒中基因組污染是怎么產生的？

當在質粒提取過程中變性和中和的步驟處理不當時，就會參數基因組污染。

如果在提取中進行溶液混合時，操作過于劇烈，就會導致基因組DNA被剪切成小片段，最后在中和時同質粒DNA一起復性保存在上清溶液中，同時被回收出來。

4.如何確定質粒小抽細胞的用量？

對于一般的載體構建等常規實驗，幾微克的DNA就足夠使用了。因此一般小提5ml菌液，都能夠滿足要求。

如果使用過量的細胞，由于試劑盒的限制，會很難把菌液裂解等，而且DNA的純度和得率并不會顯著提高。所以對于需要大量的質粒時，因考慮更換提取試劑盒或者按比例提高各溶液的用量。

5.電泳分析抽提的質粒會看到什么？

如果是制備出來純度非常差的質粒，那么從電泳加樣孔往下，您看到的條帶依次是基因組DNA，開環環裝質粒（opencircularplasmid），超螺旋質粒(SuperCoiled)，變性的超螺旋質粒（denaturedsupercoiledplasmid），細菌RNA。

高質量質粒膠圖主要部分為超螺旋質粒，沒有RNA等的污染。

6.質粒制備的得率是由哪些因素決定的？

屬主細胞類型、大腸桿菌的數量、質粒的拷貝數和提取過程中使用純化方式（試劑盒類型）。

7.您的質粒需要什么樣的純度？

同樣對于一般的載體構建等常規實驗和送去測序檢測的話，用手工和試劑盒制備的DNA都能達到要求。

如果是質粒需要用來做細胞轉染實驗的話，則需要無熱源，無內毒素（LPS）。

8.為什么酶切鑒定“有插入片段”的

質粒測序卻發現是空的？

產生這種現象的最主要的原因是提取質粒的過程中產生了變性的超螺旋質粒，限制性內切酶無法對它進行酶切。所以在判斷酶切效果時通過電泳進行分析，變性的超螺旋質粒常常被誤認為是酶切下來的片段，導致誤判。其實只需要在酶切后的電泳分析增加一個原始質粒進行對照就可以避免誤判。

9.如何判定DNA的純度和濃度？

使用試劑盒抽提的質粒DNA，可以通過儀器檢測OD260和OD280濃度，通常OD260/OD280的比值在1.7-1.8之間。估算質粒濃度可以通過瓊脂糖電泳來判斷會更準確一些。

10.為什么有些純化的質粒時間長了會發生降解？

如何解決？

產生這個問題的原因有很多，主要還是因為核酸酶的污染。

除了在質粒提取過程中會帶入核酸酶外，根據有關報道發現，質粒屬主細胞的種類也會影響到抽提質粒的質量。如果提取的質粒需要長期保存，可以使用內含豐富的核酸酶活性的大腸桿菌，比如DH5α,DH1,HB101等。