實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是用來檢測細(xì)胞增殖能力、侵襲性、對(duì)殺傷因素敏感性等項(xiàng)目的重要技術(shù)方法。

當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為集落或克隆。其中細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。

貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。

克隆形成率反映細(xì)胞群體 依賴性和 增殖能力兩個(gè)重要性狀。

克隆形成的目的

1）通過對(duì)細(xì)胞處理后在細(xì)胞培養(yǎng)板上的克隆形成能力來提示處理后細(xì)胞的增殖能力。

2）評(píng)價(jià)不同殺傷因素(藥物、基因等)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力或群體依賴性的敏感性;

3）評(píng)價(jià)細(xì)胞在體內(nèi)成瘤性，癌細(xì)胞不一定都可以在體內(nèi)成瘤，但若體外克隆能力越強(qiáng)，即表明體內(nèi)成瘤性越強(qiáng)，算是一種模擬體內(nèi)成瘤的體外實(shí)驗(yàn)。

克隆形成的分類

克隆形成依據(jù)采用的培養(yǎng)介質(zhì)的不同，分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類。

1. 平板克隆形成（Colony formation）：細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，應(yīng)用于貼壁的細(xì)胞。

2. 軟瓊脂克隆形成（soft agar colony formation）：細(xì)胞被瓊脂糖掛起來，主要應(yīng)用于懸浮的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。

下面我們就具體看一下這2種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的具體操作。

01

平板克隆實(shí)驗(yàn)過程

所需材料

· 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（根據(jù)細(xì)胞選擇適用種類）

· 胎牛血清

· 胰蛋白酶

· PBS

· 青霉素-鏈霉素溶液（100X）

· 多聚甲醛固定

· 結(jié)晶紫染液

· Giemsa染液

實(shí)驗(yàn)步驟

一、6孔板

1.將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)；

2.細(xì)胞接種：于6孔板培養(yǎng)板中各實(shí)驗(yàn)組接種400-1,000個(gè)細(xì)胞/孔（根據(jù)細(xì)胞生長情況確定，一般為700個(gè)細(xì)胞/孔）;

3.繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)；

4.克隆完成后，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次；

5.每孔加入結(jié)晶紫染液1ml，染細(xì)胞10-20 min；

6.PBS 洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干，數(shù)碼相機(jī)拍照（分別對(duì)整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨(dú)拍照）。

注意事項(xiàng)

1.每隔3天進(jìn)行換液，在換液時(shí)，緩慢加入培養(yǎng)基，避免吹起細(xì)胞。

2.染色完成后，務(wù)必將染液清洗干凈，不要在孔中有殘留。

二、平皿

1.取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）中備用。

2.將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組5個(gè)平行樣。每組細(xì)胞每皿分別接種100個(gè)細(xì)胞于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。

3.置37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。

4.當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。

6.去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘

7.用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

8.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于 10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%

注意事項(xiàng)

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。

實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。

數(shù)據(jù)分析

顯微鏡下觀察陽性克隆，即每個(gè)克隆>50個(gè)細(xì)胞，相機(jī)拍照，數(shù)克隆數(shù)（大小約在0.3-1.0 mm）計(jì)算克隆形成率，并統(tǒng)計(jì)克隆大小。

例：如研究某個(gè)基因?qū)?xì)胞增殖的影響，敲低前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3的TCTN1基因，顯微鏡下拍照（Scale bar=250 μm）和相機(jī)拍照，克隆的大小和數(shù)量均受到抑制。

02

軟瓊脂克隆形成

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實(shí)驗(yàn)Anchorage-independent assay，利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質(zhì)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長。

某些惡性腫瘤細(xì)胞，不僅在貼壁狀態(tài)下能增殖，在懸浮狀態(tài)下也能增殖，進(jìn)而通過軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。

1. 具體過程：如下圖所示




1.配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后，維持在42℃中使其不會(huì)凝固；

2.將1.2% 瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

3.將制備好的單細(xì)胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培養(yǎng)基，每3天更換一次；

4.根據(jù)細(xì)胞的生長速度培養(yǎng)2~3周后顯微鏡下觀察克隆大小，與平板克隆一樣，每個(gè)克隆>50個(gè)細(xì)胞，顯微鏡拍照。若拍整個(gè)孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）染色，37°C過夜，拍照。

2. 數(shù)據(jù)分析：顯微鏡或相機(jī)拍照，計(jì)算克隆形成率

例：通過軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測ME2蛋白對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GBM8401中將ME2蛋白敲低，形成的克隆數(shù)減少。

注意事項(xiàng)

1.上層軟瓊脂使細(xì)胞分散成單個(gè)，下層軟瓊脂作為支撐防止細(xì)胞貼附生長。最后鋪上一層培養(yǎng)基是為了防止膠干燥，并給細(xì)胞補(bǔ)充營養(yǎng)，如果做藥物處理，則在培養(yǎng)基中加入藥物。

2.上層膠細(xì)胞數(shù)目根據(jù)不同的細(xì)胞類型而定。一般以5000個(gè)細(xì)胞/孔作為起始濃度，根據(jù)需要調(diào)整。

3.瓊脂放入水浴鍋中維持在42℃左右。溫度過低瓊脂凝固，在做基底時(shí)瓊脂凝固過快會(huì)導(dǎo)致不均一，溫度過高則會(huì)將細(xì)胞燙死。此外，實(shí)驗(yàn)過程中速度要快，防止局部結(jié)塊。

2種細(xì)胞克隆方式，如何選擇那？

根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象和目的選擇，平板克隆檢測貼壁腫瘤細(xì)胞的增殖能力和致瘤性，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)除了檢測貼壁細(xì)胞，還能檢測懸浮腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，具有平板克隆不可取代的優(yōu)勢。若只是簡單評(píng)價(jià)貼壁細(xì)胞的增殖能力和群體依賴性，則選擇平板克隆即可。