ELISA是蛋白定量的金標(biāo)準(zhǔn)，也是免疫學(xué)研究中最常用的實驗方法之一。很多人覺得ELISA很簡單，其實不然。遠(yuǎn)慕生物帶你繞開ELISA實驗中出現(xiàn)的各種問題，輕松搞定ELISA實驗~

酶聯(lián)免疫吸附實驗

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。
酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）用于：

（1）免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位；

（2）研究抗酶抗體的合成；

（3）顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)；

（4）定量檢測體液中抗原或抗體成份。

優(yōu)點(diǎn)：快速、靈敏、定性、定量、定位

實驗原理

1.包被：抗原/抗體，固相化

2.反應(yīng)： 1)待測抗體/抗原； 2)酶標(biāo)抗原/抗體

3.洗滌：使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離

4.底物顯色：定性/定量分析

常用的酶與底物：

酶底物顯色測定波長

辣根過氧化物酶horseradish pero

xidase,HRP鄰苯二胺（OPD）橘紅色492nm

四甲基聯(lián)苯胺（TMB）黃色450nm

堿性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸鹽(p-NPP)黃色405nm

終止液：2mol/L  H2SO4

 常用方法

1.間接法

檢測抗體最常用的方法, 主要用于對病原體抗體的檢測。

優(yōu)勢：二抗可以加強(qiáng)信號，而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標(biāo)記的一級抗體則能保留它最多的免疫反應(yīng)性。

缺點(diǎn)：交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高

2.雙抗體夾心法

檢測大分子抗原最常用的方法。

優(yōu)勢：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。

缺點(diǎn)：抗原一定得擁有兩個以上的抗體結(jié)合部位。

3.競爭法

檢測小分子半抗原（藥物、激素等）。

優(yōu)勢：可適用比較不純的樣本，而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。

缺點(diǎn)：整體的敏感性和專一性都較差。

常見問題分析

Q1.標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。

標(biāo)準(zhǔn)品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定最佳。

 Q2.標(biāo)曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。

 推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

 Q3.標(biāo)曲顯色，樣本不顯色

當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng)，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度最高的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。

對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結(jié)果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。

 Q4.標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大

這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大；實驗者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對復(fù)孔的CV也有很大影響。

掌握移液器的正確使用和維護(hù)。關(guān)于個人的操作可練習(xí)移液動作、加快速度，確保移液的精密度。

Q5.本底偏高，樣本值測不到

標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導(dǎo)致無法測到樣本值。

 在加入TMB顯色后，需實時觀察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng)。

 Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大

有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋，那么我們就會做下預(yù)實驗，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢？

 這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當(dāng)某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。

 Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響