培養基的制備和使用是微生物實驗室檢測工作的重要環節，培養基自身質量的優劣、保存是否得當、配制使用是否正確等都直接影響到檢測結果的準確性。本文對微生物實驗室在培養基購置、貯存、制備、使用等方面應采取的質量控制措施進行討論，談一些觀點和看法。希望有助于微生物檢測工作的小伙伴們更好地開展工作。

培養基，是指供給微生物、植物或動物（或組織）生長繁殖的，由不同營養物質組合配制而成的營養基質。一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）、維生素和水等幾大類物質。培養基既是提供細胞營養和促使細胞增殖的基礎物質，也是細胞生長和繁殖的生存環境。

培養基的購置與驗收

1、購置

從培養基自身的質量來看，不同生產廠家的產品，甚至同一廠家不同批號的產品都會存在差異。依據ISO/IEC17025《檢測和校準實驗室能力的通用要求》，對培養基的供應企業進行評價后選擇合格的供應商，這是培養基購買過程中重要的步驟。應選擇產品市場信譽度高、有質量保證能力和服務保證能力的企業；企業是否通過了質量管理體系的認證是較為客觀的評價指標。

要求生產企業提供：培養基成分名稱及產品編號、批號、使用前的pH、儲藏信息和有效期、性能評價和所用測試菌株、技術數據清單、質控證書以及必要的安全/危害數據等材料。

2、驗收

購買的培養基到貨后，應有專人做好接受和驗收工作，應仔細核對生產企業提供的資料、培養基名稱、規格數量、外觀特征、批號、保質期是否符合要求。每批培養基到貨后都應對培養基的質量進行檢測，滿足檢測方法規定的要求后方可投入使用。

培養基的儲存

干粉培養基應保存在陰涼干燥處，要避免陽光直射；未開瓶的培養基在室溫下的保存期限以廠家提供為準，開瓶后的干粉培養基易吸濕，應注意防潮并盡快用完。

應定期對儲存中的培養基進行常規檢查，如容器密閉性復查、首次開封日期、內容物的感官檢查，如果培養基發生結塊、顏色異常和其他變質跡象就不能再使用。

培養基的制備

1、培養基用水

培養基制備用水應使用電阻率不小于30萬Ωcm的蒸餾水或與其同質的水，最好不使用離子交換器生產的去離子水。

2、稱量

稱量時要用專用的角匙，避免交叉污染而影響檢驗結果；干粉培養基易吸潮，如有條件，盡量在濕度較低的房間稱取培養基。

3、復水

復水時不得用銅鍋或鐵鍋，以防有離子混入培養基中，影響微生物的生長；容器的大小需大于復水后培養基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過程中，培養基溢出；含有瓊脂粉的培養基，在加熱溶解之前可以浸泡數分鐘；加熱培養基時一定要進行攪拌，特別是瓊脂類培養基。為避免燒焦和沸騰溢出，對于少量的培養基最好使用沸水浴進行加熱。

燒糊的培養基營養物質被破壞，并可產生有毒物質，如發現焦化，或未溶解均勻前培養基有溢出，該培養基即不能使用，應重新制備。對于瓊脂類培養基進行再融化時應使用沸水浴或流動蒸汽進行加熱，最多只能加熱兩次，第二次再融化后仍未用完的培養基應棄去。

4、滅菌

一般培養基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽滅菌，通常是121℃ 15 min，含糖或特殊培養基，按照國家標準或生產商提供的說明滅菌。已配制好的培養基必須立即滅菌，避免微生物生長繁殖而消耗養分，改變培養基的酸堿度。

高溫可破壞培養基的營養成分，還會使瓊脂的凝膠強度下降，因此必須嚴格控制滅菌溫度和時間，并且不可重復滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表等要定期進行檢定，并定期采用生物指示菌法或化學變色紙片對滅菌效果進行驗證。

5、pH測定

微生物必須在適宜的pH范圍內才能正常生長繁殖或體現其生物特性。培養基配方要求的pH為滅菌或消毒后的pH 值，即培養基使用前的pH，并應在25℃溫度下采用精密酸度計進行測量，固體瓊脂培養基應以特殊的膠體表面測量電極進行測量。使用過程中，如果需要調整培養基的pH，應用1mol/L Na0H或 lmol/LHCL調整，注意不可反復調pH，否則會影響培養基的滲透壓。

6、配制好的培養基保存

滅菌以后培養基應該迅速冷卻至所需溫度，避免長時間保存在滅菌鍋內，造成過度滅菌，影響培養基的營養成分或選擇性效果。

所配制的培養基的量，應該是在最長保存期限內正好使用完。含染料的培養基應閉光保存；倒好的瓊脂平板如果配制的當天未使用完，應于冷藏保存，如果保存時間超過2天，應將其放入密封的塑料袋中保存；配好的肉湯類培養基如果保存時間超過2個星期，應將其放在帶有螺旋蓋的試管或其它密閉的試管或容器中防止蒸發。

培養基的性能測試

1、外觀控制

制備好的培養基應有相應的顏色，一般的培養基應澄清、無渾濁、無沉淀。使用前應檢查培養基的顏色是否發生變化，是否蒸發/脫水。

2、污染控制

從每批制備好的培養基中選取部分進行污染測試（空白試驗），確定無微生物生長方可使用。

3、性能測試

（1）測試菌株選擇：測試菌株是具有其代表種的穩定特性并能有效證明實驗室特定培養基最佳性能的一套菌株，應來自國際/國家標準菌種保藏中心ATCC標準菌株或其他有證書的菌株。

（2）定量測試方法：改良Miles-Misra法。測試菌株過夜培養物10倍遞增稀釋；測試平板和參照平板劃分為4個區域并標記；從最高稀釋度開始，分別滴一滴稀釋液于試驗平板和對照平板標記好的區域；將稀釋液涂滿整個1/4區域，37°C培養18小時；對易計數的區域計數，按公式計算生長率（生長率=待測培養基平板上得到的菌落總數/參考培養基平板上獲得的菌落總數）。非選擇性培養基上目標菌的生長率應不低于0.7，該類培養基應易于目標菌生長；選擇性培養基上目標菌的生長率應不低于0.1 。

（3）半定量測試方法：改進的劃線法接種法。平板分ABCD四區，共劃16條線，平行線大概相隔0.5cm，每條有菌落生長的劃線記作1分，每個僅一半的線有菌落生長記作0.5分，沒有菌落生長或生長量少于劃線的一半記作0分，分數加起來得到生長指數G。目標菌在培養基上應呈現典型的生長，而非目標菌的生長應部分或完全被抑制，目標菌的生長指數G大于6時，培養基可接受 。

（4）定性測試方法 ：平板接種觀察法。用接種環取測試菌培養物，在測試培養基表面劃平行直線。按標準中規定的培養時間和溫度對接種后的平板進行培養，目標菌應呈現良好生長，并有典型的菌落外觀、大小和形態，非目標菌應是微弱生長或無生長 。

另外對選擇性培養基還應選擇被抑制生長的菌株進行培養基驗收。

以下是一些實驗室在制作培養基時候的經驗總結 ：

1、培養基配方選擇

同一種培養基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所用的是標準方法，應嚴格按其規定進行配制外，一般均應盡量收集有關資料，加以比較核對，再依據自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。

2、培養基制備記錄

每次制備培養基均應有記錄，包括培養基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等，記錄應復制一份，原記錄保存備查，復制記錄隨制好的培養基一同存放、以防發生混亂。

3、培養基成份稱量

培養基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷。可將配方置于傍側，每稱完一種成分即在配方上做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側，每種稱取完畢后，即移放于右側。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。

4、培養基成份的混合與溶化

培養基所用化學藥品均應是化學純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養基中，使細菌不易生長。最好使用不銹鋼加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置于高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。

5、培養基pH值的調正

pH因培養基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養基各成分完全溶解后，應進行pH的初步調正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應隨時注意探索經驗、以期能掌握培養基的最終pH，保證培養基的質量。pH調整后，還應將培養基煮沸數分鐘，以利培養基沉淀物的析出。

6、培養基過濾澄清

液體培養基必須絕對澄清，瓊脂培養基也應透明無顯著沉淀，因此，須要采用過濾或其它澄清方法以達到此項要求。一般液體培養基可用濾紙過濾法，濾紙應折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。

瓊脂培養基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復過濾。如過濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法。

即將冷卻至55～60℃的培養基放入大的三角燒瓶內，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養基加入1～2個雞蛋的蛋白，強力振搖3～5分鐘，置于高壓蒸汽滅菌器中、121℃加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。

7、培養基分裝

培養基的分裝，應按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當容器內。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎(現試管一般多有用螺旋蓋者)。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養基時，分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為恰當。

分裝容器應預先清洗干凈并經干烤消毒，以利于培養基的徹底滅菌。每批培養基應另外分裝20ml培養基于一小玻璃瓶中，隨該批培養基同時滅菌，以為測定該批培養基最終pH之用。

8、培養基滅菌

一般培養基可采用121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養基制備方法中，如無特殊規定，即可用此法滅菌。

某些畏熱成分，如糖類，應另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術、定量加于培養基。明膠培養基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術抽取和加入于經冷卻約50℃左右的培養基中。

瓊脂斜面培養基應在滅菌后立即取出，冷至55-60℃時，擺成適當斜面，待其自然凝固。

9、培養基質量測試

每批培養基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發現破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。將全部培養基放入36±1℃恒溫箱培養過夜，如發現有菌生長，即棄去。用有關的標準菌株接種1～2管或瓶培養基，培養24～48小時，如無菌生長或生長不好。應追查原因并重復接種一次，如結果仍同前，則該批培養基即應棄去，不能使用。

（1）澄清度

水是細胞培養基的溶劑。細胞培養基中的營養成分只有完全溶解于水才能被細胞吸收攝取，細胞才能生長增殖，因此細胞培養基是否溶解以及培養液是否透明澄清直接影響培養基使用。該項目是通過對水溶解后的細胞培養基的澄清度檢查，判斷細胞培養基的澄清度。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅨB進行。

（2）pH值

哺乳類動物細胞生長需要合適的酸堿度，pH過高或者過低都會導致細胞死亡。pH值的測定也可以檢查細胞培養基的批間差。清大天一標準規定取規定量供試品，用注射用水（水溫20℃-30℃）溶解至1L，加入規定量碳酸氫鈉到上述溶液中，用與細胞培養基溶液pH值相近的兩點標準緩沖液校準后的酸度計進行測定。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅥH進行；加入規定量的碳酸氫鈉到上述溶液中，按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅥH進行。

（3）干燥減量的質量分數

細胞培養基具有吸濕性，在空氣中放置水分會很快升高，干燥減量的質量分數表示產品中含濕量。細胞培養基是有菌制劑，其豐富的營養成分有利于微生物生長，控制細胞培養基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持細胞培養基的養分。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅧL干燥失重測定法進行。

（4）滲透壓

溶劑通過半透膜由低濃度向高濃度溶液擴散的現象稱為滲透，阻止滲透所需施加的壓力，稱為滲透壓。細胞必須生活在等滲環境中，動物細胞借助K＋、Na＋維持滲透平衡。大多數細胞對滲透壓有一定的耐受性。但是培養液滲透壓過高容易使細胞脫水萎縮，培養液滲透壓過低容易使細胞膨脹破裂，因此要控制培養基的滲透壓范圍。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅨG滲透壓摩爾濃度測定法進行。

（5）細菌內毒素

細菌內毒素是許多病原性細菌所產生的毒素。它的特殊性在于不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有生物活性的物質。培養基細菌內毒素過高，對生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程藥品等注射用的藥品都需要檢查細菌內毒素。因此本項目的檢驗符合生物制品質量控制要求。

常規細胞培養基的細菌內毒素標準定為＜10EU/ml。稱取本品規定量（見表4-12）的1/100，加入細菌內毒素檢查用水10mL溶解，吸取該溶液0.1mL加細菌內毒素檢查用水3.9mL，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅪE細菌內毒素檢查法中的凝膠法進行。

（6）微生物限度

細胞培養基不是無菌產品，其中的微生物在一定條件下會吸收細胞培養基中的營養物質滋生繁殖，導致細胞培養基變質失效。控制細胞培養基中細菌和霉菌，是延長細胞培養基有效期的方法之一。

參考《中華人民共和國藥典》2005版二部附錄第100頁的口服給藥制劑的微生物限度標準，并嚴于該標準，規定細胞培養基產品的細菌數每1g不得超過200個，霉菌數每1g不得超過50個。稱取樣品1g，加入無菌純化水10mL溶解，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅪJ微生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數、霉菌數。檢查法采用平皿法。

（7）細胞生長試驗

這是一個性能特性表述的要求。細胞培養基的功能就是培養哺乳類動物細胞，因此經過細胞培養效果的檢驗是產品質量優劣的直觀表述，這也是很多生物制藥用戶要求的一項指標。

目前國內尚無細胞培養和計數的法定方法，可參考《體外培養的原理與技術》中細胞計數法論述的內容給出。按產品說明書配制培養液進行細胞培養，前四天用含10%小牛血清的培養液培養，觀察細胞形態并計數，檢查細胞培養基是否有促生長的能力。后三天用不含小牛血清的培養液維持培養，觀察細胞形態并計數，檢查細胞培養基中是否有不利細胞生長的毒素。本試驗用細胞為VERO細胞。

10、培養基保存

培養基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養基不宜超過3天。每批培養基均必須附有該批培養基制備記錄副頁或明顯標簽。