實驗方法原理

1. 有些細菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍色。

2. 細菌產生的脂肪酶能分解培養(yǎng)基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培養(yǎng)基pH下降，可通過在油脂培養(yǎng)基中加入中性紅做指示劑進行測試。中性紅指示范圍為pH6.8（紅）——8.0（黃）。當細菌分解脂肪產生脂肪酸時，則菌落周圍培養(yǎng)基中出現紅色斑點。

3. 某些細菌分泌蛋白酶分解明膠，產生小分子物質。如果細菌具有分解明膠的能力，則培養(yǎng)基可由原來固體狀態(tài)變成液體狀態(tài)。

4. 牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。細菌對牛乳的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊中性時呈淡紫色，酸性時呈紅色，堿性時呈藍色，還原時則部分或全部脫色。細菌對牛乳的利用可分三種情況：（1）酸凝固作用：細菌發(fā)酵乳糖后，產生許多酸，使石蕊牛乳變紅，當酸度很高時，可使牛乳凝固，此稱為酸凝固。（2）凝乳酶凝固作用：某些細菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，這種凝固在中性環(huán)境中發(fā)生。通常這種細菌還具有水解蛋白質的能力，因而產生氨等堿性物質，使石蕊變藍。（3）胨化作用：酪蛋白被水解，使牛乳變成清亮透明的液體。胨化作用可以在酸性條件下或堿性條件下進行，一般石蕊色素被還原褪色。

實驗材料

大腸桿菌 枯草桿菌 金黃色葡萄球菌 產氣腸桿菌 銅綠假單胞菌 黏乳產堿桿菌 普通變形桿菌

試劑、試劑盒

油脂培養(yǎng)基 淀粉培養(yǎng)基 明膠液化培養(yǎng)基 石蕊牛乳培養(yǎng)基

儀器、耗材

平皿 接種環(huán) 酒精燈 試管 接種針

一、 淀粉水解試驗

1. 準備淀粉培養(yǎng)基平板：將熔化后冷卻至50℃左右的淀粉培養(yǎng)基倒入無菌平皿中，待凝固后制成平板。

2. 接種：用記號筆在平板底部劃成兩部分，在每部分分別寫上菌名，用接種環(huán)取少量的待測菌，點接在培養(yǎng)基表面的相對應部分的中心，其中一個菌種應是枯草桿菌做對照菌

3. 培養(yǎng)：將接種后的平皿置于28℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

4. 檢測：取出平板，打開平皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉，使碘液均勻鋪滿整個平板。菌落周圍如出現無色透明圈，則說明淀粉已經被水解，表示該細菌具有分解淀粉的能力。可以用透明圈大小說明測試菌株水解淀粉能力的強弱。

二、油脂水解試驗

1. 將裝有油脂培養(yǎng)基的三角瓶置于沸水浴中熔化，取出并充分振蕩，使油脂均勻分布，再傾入無菌平皿中，待凝固成平板。

2. 接種：于同一平皿的兩邊接種，其中一種是金黃色葡萄球菌作為對照菌。置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，取出后觀察平板菌苔顏色，如果出現紅色斑點，即說明脂肪被水解了，此反應為正反應。紅色斑點大小說明測試菌株水解脂肪能力的強弱。

三、明膠液化試驗

1. 接種：用穿刺接種法接種大腸桿菌或產氣腸桿菌于明膠培養(yǎng)基中。

2. 培養(yǎng)：放20℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。若細菌在20℃下不長，則應放在最適溫度下培養(yǎng)。

3. 觀察結果：觀察培養(yǎng)基有無液化情況及液化后的形狀。因明膠在低于20℃時凝固，高于25℃時自行液化，若是在高于20℃下培養(yǎng)的細菌，觀察時應放在冰浴中觀察，若明膠被細菌液化，即使在低溫下明膠也不會再凝固。

四、石蕊牛乳試驗

1. 接種：將黏乳產堿桿菌和銅綠假單胞菌接種入石蕊牛乳培養(yǎng)基中。

2. 培養(yǎng)：將接種后的試管于37℃恒溫培養(yǎng)7d，另外保留一支不接種的石蕊牛乳培養(yǎng)基作為對照。

3. 結果觀察：取出培養(yǎng)物，以不接種任何細菌的試管為對照，觀察接種不同細菌生長后的變化情況。                              

五、甲基紅試驗(M.R.試驗)

將大腸桿菌和產氣桿菌分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)?24h，加甲基紅指示劑數滴，觀察結果，呈現紅色者為陽性，呈現黃色者為陰性。

注意事項

1. 在淀粉水解實驗中，觀察各種細菌的生長情況，加入碘液時要輕輕旋轉，使得碘液均勻鋪滿整個平板。

2. 每個實驗需要設置陰性和陽性對照組，以保證實驗結果。

3. 細胞生長較快，需要及時觀察和記錄。

4. 接種前要用記號筆做好標記，接種時要對號接種。

其他

1.如何解釋淀粉酶為胞外酶而非胞內酶：淀粉為大分子物質，進入細胞很困難，甚至需要高耗能的胞吞作用，因而通過胞外酶的作用，將淀粉水解為較小分子葡萄糖后再運入細胞內，不需要高耗能的胞吞作用。

2. 碘液的作用：由于淀粉經過水解會生成葡萄糖，葡萄糖為多羥基醛，因此可以利用醛這個基團的特征性質進行驗證，比如銀鏡反應，斐林試劑等，呈陽性說明淀粉水解產生葡萄糖。陰性則說明淀粉沒有被水解。