實驗方法原理：

本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。

這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。

實驗材料：血清 血漿 體液

試劑、試劑盒：碳酸鹽包被緩沖液 抗體球蛋白 吐溫 檸檬酸 硫酸

儀器、耗材：酶標比色計 96孔板 移液槍 離心管 離心管盒

實驗步驟：

一、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時，貯存冰箱。

二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

三、每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標本，37℃作用1～2小時。

四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

五、加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時或由預試實驗確定作用時間。

六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

七、加入0.2ml底物溶液于每個凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。

八、加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。

九、觀察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（OPD用492nm）OD值。

注意事項：

1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質可作為固相載體，如纖維素、交聯右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。

2.包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優質和穩定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學活性。

3.對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養和雞胚培養物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經提純是不能使用的。

4.用最適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經濟，而且可以克服前帶現象。可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結合物進行反應，經孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定OD值，選擇OD值≥1.0的那個抗原稀釋度為最適包被濃度。一般總是要選擇那個OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。

5.抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加完全且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質的濃度為1-10 ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應通過滴定。