細胞凍存是將細胞儲存在低溫環境中，減少細胞代謝，實現長期儲存的一種技術。在大多數細胞系中，細胞會隨著衰老和演化不斷的積累改變，造成表型和基因型的“培養漂移”，在凍存過程中，適當的操作和合適的凍存條件可以減少細胞特性的改變或丟失，起到細胞保種的作用。因而，正確且成功的凍存對于細胞的長久應用起著非常重要的作用。

01、正確的培養和溫和的細胞收集

在凍存前，細胞應保持最佳的生長狀態(處于對數期或指數期)，理想情況下，培養基應在收獲前24h更換。建議對培養物進行微生物污染物檢測，特別是支原體，確保細胞沒有任何的污染。在細胞的收集過程中，實驗操作要盡可能的溫和，避免細胞受損。

02、適當的低溫保護劑

目前，細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞，減少在冷凍過程中對細胞的損害。細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存，細胞內外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。

聚乙烯基吡咯烷酮、乙二醇、甲醇和甲基乙酰胺等都是低溫保護劑。在細胞凍存中最常見的是二甲基亞砜(DMSO)和甘油，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，關鍵在于對細胞無明顯毒性。DMSO通常濃度為5 - 10% (v/v)，最佳濃度隨細胞系的不同而不同。甘油在冷凍介質中的最終濃度為5 - 15%，同樣，最佳濃度取決于細胞系。為了提高較難保存的細胞的存活率，凍存時可以選擇增加保存液中的血清濃度。想要凍存細胞更快更穩，細胞凍存液會是不錯的選擇，無需配制，直接在細胞中加入適量的凍存液即可，操作簡單，就能擁有高活率的細胞。

03、緩慢的凍存速度

慢速凍存對細胞活力的恢復是非常重要的。對大多數動物細胞，每分鐘降低-1到-3℃能讓細胞更好適應凍存狀態。目前大多數實驗室常用的方法是梯度降溫法：在4℃放置30 min，再轉入-20℃存放 2h，接著轉入-80℃冰箱冷凍過夜，次日將凍存管轉移到液氮罐中長期保存。一款可重復使用的細胞凍存盒，可省去多次反復轉移細胞的時間，將準備好的細胞凍存管放進凍存盒，直接在-80℃過夜后就可以轉移至液氮罐中。無論使用哪種凍存方法，重要的是在轉移存放位置的過程中一定要迅速，轉移時建議將凍存管放在干冰中恒溫，盡量避免轉移過程因溫度變化對細胞活力的影響。

04、持續的低溫儲存

細胞溫度應始終保持在-130℃以下，才能達到最佳存活率。如果存放溫度控制不好，存活率會隨著時間的推移而降低。建議將細胞在液氮條件下長期保存，需要定期人工檢查液氮罐的密閉性和液氮量是否充足，避免因儲存條件造成細胞的損毀。