樣品前處理

相對(duì)于傳統(tǒng)人工操作模式及重復(fù)使用的均質(zhì)乳缽器和攪拌刀頭，目前市場(chǎng)上出現(xiàn)品類豐富的一次性均質(zhì)袋、與樣品隔離的拍打式均質(zhì)系統(tǒng)及自動(dòng)化重量梯度稀釋儀，不僅實(shí)現(xiàn)了樣品前處理的自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化及批量化，而且免除了樣品間的交叉污染。

增菌培養(yǎng)及分離

不論傳統(tǒng)方法或現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)，受檢測(cè)靈敏度的限制，食品樣本經(jīng)前處理后多需經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)、選擇性分離后方可用于后續(xù)檢測(cè)分析。傳統(tǒng)微生物檢測(cè)中上述兩個(gè)步驟耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)24－96ｈ，為整個(gè)檢測(cè)流程中的關(guān)鍵限速步驟。因此，建立高效增菌策略以及靶標(biāo)高度特異性微生物濃縮、分離系統(tǒng)已成為實(shí)現(xiàn)微生物快速檢測(cè)的核心。

2.1 增菌條件優(yōu)化

為了縮短增菌時(shí)間、提高檢測(cè)效率，國(guó)內(nèi)外許多研究者致力于致病菌選擇性增菌條件改良。如通過(guò)單因素篩選、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的增菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，使其在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的菌液濃度達(dá)到國(guó)標(biāo)增菌方法的1.8倍；相對(duì)于通用的耗時(shí)48ｈ李氏增菌肉湯LB１和LB２兩步增菌法，美國(guó)學(xué)者研發(fā)了一步法ｏPＳＵ增菌肉湯，適用于巴氏殺菌奶和熱狗等即食類食品中單增李斯特菌的快速檢測(cè)。此外，為了滿足當(dāng)前食品致病菌多重化檢測(cè)的需求，在同一體系內(nèi)實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)菌共增菌的富集培養(yǎng)基優(yōu)化也日益受到關(guān)注。

如針對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌O157：Ｈ7及單增李斯特菌的復(fù)合培養(yǎng)基SEL，經(jīng)多重PCR及免疫法驗(yàn)證了其良好的復(fù)合增菌效果。國(guó)內(nèi)研究者通過(guò)優(yōu)化也分別獲得了可同時(shí)富集沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌或單增李斯特菌的共增菌培養(yǎng)基，３種致病菌在優(yōu)化條件下能以相對(duì)一致的速度增殖，增菌液可滿足下游多重ＰＣＲ檢測(cè)要求，有效提高了檢測(cè)效率。

2.2  細(xì)菌分離與濃縮

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了多種食源性致病菌的高效分離、濃縮法，基于其原理，主要可分為包括離心、過(guò)濾等在內(nèi)的物理法和賴于免疫反應(yīng)的吸附法。

2.2.1 密度梯度離心法

離心可將大體積樣本中的細(xì)菌經(jīng)沉淀而濃縮，而后加入梯度密度的緩沖液，經(jīng)多次的離心、洗滌最終實(shí)現(xiàn)細(xì)菌與食品基質(zhì)的分離。

盡管離心法在細(xì)菌富集中具有一定的優(yōu)勢(shì)，但其需經(jīng)多次離心－洗滌反復(fù)循環(huán)而實(shí)現(xiàn)，耗時(shí)且影響濃縮效率；另外，其濃縮對(duì)象為所有細(xì)菌，缺乏靶標(biāo)特異性。相對(duì)于此，基于抗原－抗體免疫反應(yīng)的吸附分離法則更顯優(yōu)勢(shì)。

2.2.2 免疫磁分離技術(shù)

免疫磁分離技術(shù)是一種高效、特異性微生物富集技術(shù)。其原理在于利用磁性微球表面偶聯(lián)的抗體特異性地吸附樣品稀釋液中的靶標(biāo)菌，而后載有致病微生物的磁性顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病菌得到分離和富集，從而大大縮短了常規(guī)檢測(cè)所需的冗長(zhǎng)的增菌時(shí)間，提高檢測(cè)效率。以其高度的靶標(biāo)特異性及與下游檢測(cè)技術(shù)的良好兼容性在食品微生物快速檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。

快速檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法包括形態(tài)觀察、生化鑒定及血清學(xué)分型等冗繁的操作，已不能滿足現(xiàn)代食品微生物檢測(cè)對(duì)靈敏度、特異性和時(shí)效性的要求。

3.1 分子生物學(xué)方法

此類方法在基因水平上對(duì)靶標(biāo)微生物進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于難培養(yǎng)或抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜微生物的鑒定及分型，主要包括ＰＣＲ、核酸分子雜交及基因芯片等技術(shù)。

3.1.1 ＰＣＲ及其衍生技術(shù)

ＰＣＲ是一種體外酶促合成特定ＤＮＡ片段的技術(shù)，它通過(guò)以變性、退火和延伸３個(gè)步驟為一個(gè)周期的循環(huán)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。相對(duì)于擴(kuò)增單一靶基因的常規(guī)ＰＣＲ，多重ＰＣＲ通過(guò)在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物來(lái)實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)基因，可用于同時(shí)檢測(cè)多種微生物或通過(guò)多基因交叉確認(rèn)來(lái)進(jìn)行特定微生物鑒定或種下分型。

實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ技術(shù)是一種通過(guò)監(jiān)測(cè)ＰＣＲ產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)累積來(lái)定性或定量分析起始模板的方法。該法全程封閉式反應(yīng)且無(wú)需ＰＣＲ后處理，避免了交叉污染及溴化乙錠等有毒物質(zhì)的使用，具有特異性強(qiáng)、高度自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)選取特異性基因設(shè)計(jì)引物及探針，ｑＲＴ－ＰＣＲ法近年來(lái)已在多種致病細(xì)菌、霉菌、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物指標(biāo)的定性和定量檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。

盡管上述ＰＣＲ及其衍生技術(shù)具有高靈敏度、快速等優(yōu)點(diǎn)，但方法實(shí)施所需的昂貴儀器設(shè)備嚴(yán)重限制了其在我國(guó)食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)的推廣應(yīng)用。

3.1.2 核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交是利用帶有標(biāo)記的特定ＤＮＡ或ＲＮＡ探針與已變性的待檢核酸樣品進(jìn)行雜交，若樣品中存在與探針互補(bǔ)的靶標(biāo)序列則二者退火形成帶標(biāo)記的雙鏈，通過(guò)對(duì)標(biāo)記物信號(hào)有無(wú)及強(qiáng)度的檢測(cè)即可實(shí)現(xiàn)微生物定性或定量分析。 分子雜交技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵在于靶標(biāo)特異性核酸片段選取及相應(yīng)探針設(shè)計(jì)及標(biāo)記。如以葡糖苷酸酶基因設(shè)計(jì)核酸探針可用于檢測(cè)食品中的總大腸桿菌，而其不同致病型的區(qū)分則需針對(duì)特異毒力基因合成適宜的探針。由于放射性標(biāo)記存在標(biāo)記元素的半衰期短、對(duì)人體及環(huán)境不友好以及需要特殊操作設(shè)備等缺陷，近年來(lái)已逐漸被非放射性ＤＮＡ探針檢測(cè)系統(tǒng)所取代，其主要通過(guò)酶促反應(yīng)將特定的底物轉(zhuǎn)變?yōu)樯镔|(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達(dá)到信號(hào)放大的目的。

3.1.3 基因芯片

基因芯片又稱ＤＮＡ微陣列，是一種高通量的核酸分子雜交技術(shù)。它通過(guò)原位合成或顯微打印將一系列探針以預(yù)設(shè)的次序固定于固相支持介質(zhì)表面，形成高密度的寡核苷酸陣列，樣品經(jīng)核酸提取、ＰＣＲ擴(kuò)增及標(biāo)記后與芯片上的探針陣列雜交，最后通過(guò)熒光掃描或酶學(xué)方法檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度和分布以確定受檢樣品中特定微生物的存在及豐度。

食品中的微生物種群具有種類廣、豐度低、隨機(jī)性強(qiáng)等特點(diǎn)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)、鑒定方法往往會(huì)掩蓋一些低豐度或不易培養(yǎng)的微生物，而ＰＣＲ、免疫雜交等現(xiàn)代技術(shù)則多限于檢測(cè)一種或少數(shù)幾種靶標(biāo)微生物或基因，難以全面分析食品受污染狀況。而基因芯片具有高通量、并行化及高度自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，為食品微生物群落結(jié)構(gòu)研究、食源性致病菌多個(gè)毒力、藥敏基因的同步化、快速檢測(cè)等提供了一個(gè)有力的平臺(tái)。

3.2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是基于抗原－抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)發(fā)展而成的蛋白質(zhì)水平上的系列檢測(cè)方法，相對(duì)于分子生物學(xué)手段其更直接地靶向微生物特異性基因的表達(dá)產(chǎn)物，在一定意義上更具說(shuō)服力。

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

 酶聯(lián)免疫吸附法是將抗原－抗體免疫反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合起來(lái)的一種固相酶免疫分析方法。相對(duì)于傳統(tǒng)ＥＬＩＳＡ的檢測(cè)限，通過(guò)單克隆抗體雙夾心法將海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)靈敏度提高了１０００～１００００倍；而以新型碳納米管作為固相吸附材料在沙門氏菌的ＥＬＩＳＡ檢測(cè)中亦取得了類似的效果。此外，許多學(xué)者還結(jié)合ＰＣＲ技術(shù)的倍增放大效果開發(fā)ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。

酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)則是近年來(lái)在ＥＬＩＳＡ基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的新型免疫熒光檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)用熒光底物代替生色底物， 提高了分析靈敏度，增寬測(cè)量范圍，減少試劑的用量。Ｍｉｎｉ－ＶＩＤＡＳ即是法國(guó)梅里埃公司根據(jù)上述原理開發(fā)的一款全自動(dòng)酶聯(lián)免疫熒光儀，實(shí)現(xiàn)了雙抗夾心的ＥＬＩＳＡ技術(shù)的自動(dòng)化。

3.2.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析將免疫反應(yīng)和層析原理相結(jié)合， 借助毛細(xì)管作用使樣品在條狀纖維制成的膜上泳動(dòng)， 其中的待測(cè)物與膜上一定區(qū)域的配體發(fā)生高特異性、高親和性的免疫結(jié)合， 通過(guò)酶促顯色反應(yīng)或直接使用著色標(biāo)記物， 在短時(shí)間（２０ｍｉｎ內(nèi)）便可得到直觀的結(jié)果。

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫層析試紙也不斷應(yīng)用于致病菌定量化檢測(cè)。此外，在同一免疫層析試紙條上進(jìn)行多種食品致病菌同步檢測(cè)的方法也正逐步被開發(fā)。通過(guò)不同光信號(hào)標(biāo)記

3.2.3 乳膠凝集反應(yīng)

乳膠凝集反應(yīng)采用人工大分子乳膠顆粒標(biāo)記抗體， 使之與待測(cè)抗原發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)，以達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)病原微生物或毒素的目的。基于乳膠凝集檢測(cè)法的高靈敏度和特異性以及結(jié)果直觀性、操作簡(jiǎn)易度等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)其在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用越發(fā)廣泛。

3.3 代謝學(xué)方法

代謝學(xué)方法是指基于微生物在生理代謝過(guò)程中發(fā)生的特異性物理、化學(xué)變化而設(shè)計(jì)的一系列檢測(cè)手段，主要包括電阻抗法、ＡＴＰ發(fā)光法和微量生化法等。

3.3.1 阻抗法

阻抗法是一種通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖時(shí)將電惰性生物大分子代謝為帶電荷的活性小分子所引起的培養(yǎng)液電阻和電導(dǎo)的變化來(lái)定量表征微生物的新型檢測(cè)方法。該法因具有高敏感性、特異性、反應(yīng)快速性以及可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)而在食品微生物快速檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。

3.3.2  ＡＴＰ生物發(fā)光法

ＡＴＰ作為機(jī)體的“能量貨幣”普遍存在于所有活體生物中且含量相對(duì)恒定，其隨機(jī)體死亡亦會(huì)被快速分解，因此測(cè)定樣品中的ＡＴＰ 濃度即可推算出其攜帶的活菌數(shù)?；诖?，ＡＴＰ發(fā)光法通過(guò)發(fā)光光度計(jì)檢測(cè)熒光素酶在ＡＴＰ的作用下氧化熒光素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，并利用其在一定范圍內(nèi)與ＡＴＰ濃度的線性關(guān)系來(lái)定量樣品中的ＡＴＰ含量，繼而推算系統(tǒng)中代謝活細(xì)胞水平。

該方法無(wú)需對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，可在數(shù)分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，且熒光光度計(jì)小巧便攜，尤其適用于大批量食品樣本細(xì)菌污染狀況以及食品加工設(shè)備清潔度的現(xiàn)場(chǎng)快速檢定。如自動(dòng)ＡＴＰ生物熒光技術(shù)已在歐洲和北美的乳品工業(yè)中廣泛應(yīng)用于生乳活菌數(shù)檢測(cè)、ＵＨＴ乳活菌數(shù)檢測(cè)、設(shè)備清潔度的評(píng)估及成品架售期的推算等。

3.3.3  微量生化法

為了滿足食品微生物快速化、標(biāo)準(zhǔn)化、批量化檢測(cè)的需求，目前市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多高精密度、高重現(xiàn)性的商品化微量生化鑒定試劑盒，大大提高了檢測(cè)速率以及結(jié)果的重現(xiàn)性。

盡管上述試劑盒已大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)微生物生化鑒定程序，但其不同反應(yīng)仍需分別加樣且結(jié)果依賴人工判讀。近年來(lái)隨著檢測(cè)科學(xué)的不斷發(fā)展，全自動(dòng)微生物生化鑒定分析系統(tǒng)也應(yīng)運(yùn)而生，通過(guò)結(jié)合現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)，該系統(tǒng)可在一次加樣后自動(dòng)完成系列生化檢測(cè)并通過(guò)概率最大近似值模型法分析后直接報(bào)告鑒定結(jié)果。上述自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)可在４－６ｈ內(nèi)同時(shí)完成數(shù)十個(gè)樣品的分析，可滿足批量化鑒定的需求，且與其他檢測(cè)方法的結(jié)果高度吻合。