中文名稱(chēng)：線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

用途：細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)分析，線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)

注意事項(xiàng)：要由JC-1染料儲(chǔ)存液，JC-1 buffer、CCCP等組成，可以檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位，采用FACS檢測(cè)。

儲(chǔ)存條件：-20℃，避光，12個(gè)月

檢測(cè)原理：

線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）是一種以JC-1 為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于檢測(cè)線(xiàn)粒體的健康狀態(tài)，也是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的常用方法。

是一種廣泛用于檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針。JC-1染料表現(xiàn)出電勢(shì)依賴(lài)性的積聚在線(xiàn)粒體內(nèi)。正常線(xiàn)粒體內(nèi)，JC-1聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的線(xiàn)粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。因此顏色的變化非常直接的反映出線(xiàn)粒體膜電位的變化。線(xiàn)粒體的去極化程度也可以通過(guò)紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來(lái)衡量。

線(xiàn)粒體膜電勢(shì)的破壞是細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志性事件。細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后線(xiàn)粒體膜電位的變化使得膜的通透性發(fā)生改變。膜通透性的增加，使得線(xiàn)粒體蛋白包括細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸內(nèi)切酶G（EndoG）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等從線(xiàn)粒體基質(zhì)釋放到細(xì)胞漿。細(xì)胞色素C的釋放伴隨膜電位的完全喪失，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡酶的級(jí)聯(lián)效應(yīng)。

JC-1染料的優(yōu)勢(shì)：

染料用途廣：可用來(lái)檢測(cè)各種細(xì)胞類(lèi)型包括單核細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，以及完整組織和純化的線(xiàn)粒體；

染料特異性更高：與其他的陽(yáng)離子染料如DiOC6(3)和羅丹明123相比，對(duì)線(xiàn)粒體膜電位變化的特異性高于質(zhì)膜電位變化，對(duì)線(xiàn)粒體去極化檢測(cè)的檢測(cè)一致性更好；

紅綠色熒光強(qiáng)度比率只受線(xiàn)粒體膜電位的變化，不受線(xiàn)粒體大小，形狀，密度的差異干擾；

檢測(cè)靈敏度強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的微小異質(zhì)性都能辨別；

操作步驟（詳細(xì)步驟請(qǐng)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）：

1. JC-1 染色工作液的配制

取適量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL 超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1 染色工作液。

2. 陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置

CCCP（10mM）推薦按照1∶1000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細(xì)胞20分鐘。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，通常10μM CCCP處理20分鐘后線(xiàn)粒體的膜電位會(huì)完全喪失，JC-1染色后觀(guān)察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對(duì)于特定的細(xì)胞，CCCP 的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。

3. 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)（懸浮細(xì)胞）

（1） 取1.0～6.0×105 細(xì)胞，重懸于0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

（2） 加入0.5mL JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。

（3） 孵育期間按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

（4） 37℃孵育結(jié)束后，600g 4℃離心3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

（5） 用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2 次：加入1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。

（6） 再用適量JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析。

4. 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)（貼壁細(xì)胞）

5. 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)（純化的線(xiàn)粒體）

6. 熒光觀(guān)測(cè)和結(jié)果分析

注意：

CCCP陽(yáng)性對(duì)照屬于線(xiàn)粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒性。操作時(shí)需避免直接接觸皮膚；

為了個(gè)人的安全和健康，請(qǐng)戴手套，口罩還有實(shí)驗(yàn)服進(jìn)行操作；