在細胞相關的實驗操作中，對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞，通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。

病毒轉染包括以下步驟：1構建載體 2包裝提純病毒 3感染靶細胞。以慢病毒為例。

慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。

一、慢病毒載體構建原理：

慢病毒載體的包裝系統一般由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能夠反式提供產生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。將包裝成分與載體成分的多個質粒共轉染包裝細胞，即可在細胞上清中收獲攜帶目的基因的復制缺陷型慢病毒載體顆粒。

慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。

對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi，cDNA 克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。對進行穩轉細胞株的篩選，為活體動物模型實驗提供高質量的包含目的基因的病毒液提供基礎。

二 、慢病毒載體構建及包裝流程：

（一） 實驗流程（1和2為并列步驟）

1.慢病毒過表達質粒載體的構建

設計上下游特異性擴增引物，同時引入酶切位點，PCR(采用高保真KOD酶，3K內突變率為0%)從模板中（CDNA質粒或者文庫）調取目的基因CDS區（coding sequence）連入T載體。將CDS區從T載體上切下，裝入慢病毒過表達質粒載體。

2.慢病毒干擾質粒載體的構建

合成siRNA對應的DNA頸環結構，退火后連入慢病毒干擾質粒載體

3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化

制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，共轉染293T細胞，轉染后6 h 更換為完全培養基，培養24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。

（二） 實驗材料：慢病毒載體、包裝細胞和菌株

該病毒包裝系統為三質粒系統，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質粒上的ZsGreen1表達框能表達綠色熒光蛋白（GFP）。

細胞株 293T，慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培養基為DMEM(含10% FBS)。貼壁細胞經培養生長增殖形成單層細胞。

菌株大腸桿菌菌株DH5α。用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒。

三、慢病毒轉染細胞實驗方法

（一）慢病毒轉染貼壁細胞實驗方法

1、 慢病毒轉染前18-24小時，將貼壁細胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×105/孔左右。

2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基替換原培養基，加入適量病毒懸液。37℃孵育。

3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養基以稀釋polybrene。

4、繼續培養24小時，用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。

5、繼續培養。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉染48小時后可見明顯熒光表達，72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉染效率，可在轉染后72-96小時進行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉染3-4天后開始加藥。

（二）慢病毒轉染懸浮細胞實驗方法

1、在2×105/ml懸浮細胞中加入polybrene至6 μg/ml和適量病毒，充分混勻。37℃孵育。或者150g室溫離心4小時(選作，部分難轉染的細胞系采用此步驟可以提高轉染效率)。

2、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后(或離心結束后)加入等體積新鮮培養基以稀釋polybrene。

3、繼續培養3-4天。中間視細胞生長情況可傳代或換液。

病毒感染細胞本來效率就較低，一定要注意以下幾點：1.感染時的培養基盡量少些；2. 每1ml的培養基中加入5-10ul的Polybrene（儲存液濃度為2mg/ml ），可以提高效率約3-5倍。不過病毒感染效率的問題都是相對的，達到自己的研究目的即可。