很多小伙伴在對膠片印跡進行短暫曝光后，檢測不到目的蛋白。可從以下幾個方面來優化實驗步驟：

1、裂解物制備

每道全細胞提取物的 20–30 ?g 總蛋白，通常足夠用來檢測。如果靶標蛋白的基礎水平，或蛋白質修飾程度低，可能需要通過化學刺激劑來誘導表達或修飾。你可能要調查備選細胞系或組織，其所含的目的蛋白含量更高。應將樣品溶解于適當的緩沖液中，該緩沖液包含蛋白酶抑制劑和針對磷酸化目標的磷酸酶抑制劑。應務必對裂解物進行超聲處理，以確保有效的染色質和膜結合靶標的蛋白質提取。請查看我們網站上的對照物表，獲得推薦的陽性對照物和處理方法。

2、一抗稀釋和/或孵育

使用推薦的封閉劑（5% BSA 或 5% 脫脂奶粉），以推薦的稀釋度溶解于 TBST 中，在 4°C 下，過夜孵育一抗。使用備選封閉劑，如明膠、血清、無蛋白封閉劑、酪蛋白、或混合封閉劑，可能降低靶標信號強度。如需單個抗體的優化結果，請查詢產品數據表找到推薦的稀釋緩沖液。

3、SDS-PAGE 凝膠選擇

一般來說，推薦采用 Tris-Glycine 凝膠。但是，對于高分子量蛋白質，我們推薦采用 Tris-Acetate 凝膠和相關緩沖液。蛋白質從 1 毫米凝膠轉移比從 1.5 毫米凝膠轉移更有效。使用更厚的凝膠，可能會導致高分子量蛋白質的轉移不完全，所以我們推薦監測轉移效率，根據目的靶標蛋白質分子量大小，優化轉移條件。

4、轉移和膜

可通過延長轉移時間或使用更高的電壓，可改善轉膜不完全。一般來說，我們建議在轉移緩沖液中加入 20% 甲醇，然后在 70 V 電壓下進行為時 2 小時的濕轉。對于高分子量蛋白質，我們建議減少轉移緩沖液中的甲醇至 5%，以提高轉移效率并避免大分子蛋白質在凝膠基質中固定，并且在 70 V 電壓下延長轉移時間至 3 小時。檢測較小的蛋白質時，可能在轉膜期間出現過度轉移（過膜蛋白質轉移）問題。對于小蛋白質分子，使用孔隙大小為 0.2 ?m 的膜并在 70 V 電壓下進行為時 1.5 小時的濕轉，而不是使用孔隙大小為 0.45 ?m 的膜或進行過夜轉移，這樣做很重要，因為后者可能會導致過度轉移和丟失小蛋白質分子信號。

5、封閉

膜封閉時間過長可能會掩蓋抗原表位，并阻止抗體結合。在室溫下僅封閉 1 小時。

6、洗滌

洗滌時間超過推薦的三次 5 分鐘是一個常見問題，可能會導致減少信號。我們推薦計時洗滌，以確保準確性。TBST 應包含 0.1% Tween? 20。這適用于一抗和二抗孵育后的洗滌步驟。此外，我們建議在 TBST 中洗滌，因為已有數據顯示在 PBST 中洗滌會導致減少信號。

7、二抗稀釋和/或孵育

可用相同的細胞提取物和一抗在印跡上進行二抗的梯度稀釋，以優化二抗濃度。務必在室溫下，在含 5% 脫脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小時。避免在 HRP-偶聯二抗的緩沖液中加入疊氮化鈉，因為疊氮化物會抑制 HRP 的活性。

8、檢測試劑

采用能用抗-生物素-HRP 進行檢測的生物素化分子量標準作為化學發光檢測的陽性對照物。