利用可溶性抗原與抗體在半固體瓊脂內進行擴散，若抗原與抗體對應，并且比例適當，就會出現白色沉淀線，此為陽性反應。瓊脂擴散試驗可在試管內、平皿中以及玻片上的瓊脂中進行。又可分為雙向瓊脂擴散試驗和單向瓊脂擴散試驗兩類。

一、瓊脂擴散試驗分類
1、雙向瓊脂擴散試驗：是將半固體瓊脂傾注于平皿內或玻片上，待其凝固后，在瓊脂板上打孔，將抗原、抗體分別注入小孔內，使兩者相互擴散。如果抗原、抗體相互對應，濃度、比例適當，則一定時間后，在抗原、抗體孔之間出現清晰可見的沉淀線。雙向瓊脂擴散法可用來分析溶液中的多種抗原。一對抗原、抗體系統只能形成一條沉淀線，不同的抗原抗體系統在瓊脂中擴散的速度不同，可在瓊脂中形成不同的沉淀線。本法主要是用于檢測血清中各種免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。缺點是需要時間過長，靈敏度不高。
2、單向瓊脂擴散試驗：是一種常用的定量檢測抗原的方法。將適量抗體與瓊脂混勻，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就會向孔的四周擴散，邊擴散邊與瓊脂中的抗體結合。一定時間后，在兩者比例適當處形成白色沉淀環。沉淀環的直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標準抗原制成標準曲線，則從曲線中可求出標本中抗原的含量。單向瓊脂擴散試驗主要用于檢測標本中各種免疫球蛋白和血清中各種補體成分的含量，敏感性很高。

二、瓊脂免疫擴散試驗方法
材料與試劑
1 瓊脂粉
2 打孔器
3 平皿
4 生理鹽水或其他緩沖液，可加萬分之一的硫柳汞或疊氮鈉防腐。

操作方法：
1、稱取一定量的瓊脂粉，按1%左右（0.8%～1.5%）的比例加入生理鹽水或緩沖液，水浴煮沸融化20min。
2、將融化的瓊脂倒入平皿內，使厚度2mm～3mm。自然冷卻。
3、根據要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔。也可直接用組合打孔器打孔。現在一般多打成梅花形孔圖。
4、挑出孔內瓊脂，注意不要挑破孔緣。
5、在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。
6、以毛細滴管吸取樣品加入孔內，注意不要產生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應程度，加多了，易溢出，也影響反應結果。
7、加畢后，蓋上平皿蓋，將平皿翻過來，置濕盤中，37℃自由擴散24h～48h。

三、結果判定
1、用以檢測抗原或比較抗原差異時，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現沉淀帶完全融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不同。
2、用做血清流行病學調查時，將標準抗原置中心孔，周圍1、3、5孔加標準陽性血清，2、4、6孔分別加待檢血清。待檢孔與陽性孔出現的沉淀帶完全融合者判為陽性。待檢血清無沉淀帶或所出現的沉淀帶與陽性對照的沉淀帶完全交叉者判為陰性。待檢孔雖未出現沉淀帶，但兩陽性孔的沉淀帶在接近待檢孔時，兩端均內向有所彎曲者判弱陽性。若僅一端有所彎曲，另一端仍為直線者，判為可疑，需重檢。重檢時，可加大檢樣的量。
檢樣孔無沉淀帶，但兩側陽性孔的沉淀帶在接近檢樣孔時變得模糊、消失，可能為待檢血清中抗體濃度過大，致使沉淀帶溶解，可將樣品稀釋后重檢。
3、用以檢測抗血清的效價時，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出現沉淀帶的血清最高稀釋倍數為該抗血清的瓊擴效價。

四、注意事項：不規則的沉淀線可能是加樣過滿溢出、孔型不規則、邊緣開裂、孔底滲漏、孵育時沒放水平、擴散時瓊脂變干燥、溫度過高蛋白質變性或未加防腐劑導致細菌污染等所致。