今天給大家帶來《qRT-PCR》之---如何提取細胞RNA！

一、基本原則
避免RNA酶污染，全程戴口罩和無菌乳膠手套（汗液和唾液中含有大量RNA酶)

二、主要試劑及儀器
Trizol、氯仿（三氯甲烷）、異丙醇、無水乙醇、DEPC水（或ddH2O)

三、操作步驟（全程戴口罩和手套）
1、Trizol處理。將細胞培養基吸出后，用預冷PBS洗滌3次，加入1ml Trizol（100mm培養皿），室溫裂解1-2min，用移液槍均勻吹下細胞并置于無菌1.5ml EP管，上下輕柔顛倒數次，室溫靜置5min。
2、加入1/5體積氯仿，顛倒混勻10次，室溫靜置5min，4度，12000rmp，離心20min。（離心機提前預冷至4度）
3、將水相轉移至新EP 管（緩吸、寧缺毋濫），加入等體積異丙醇，顛倒混勻10次，室溫靜置10min，4度，12000rmp，離心15min。
4、用真空泵或移液槍小心吸取上清液，加入預冷75%乙醇（無水乙醇配置）， 4度，12000rmp，離心10min。
5、棄上清液，EP管倒扣，空氣干燥5~10min。
6、10~100ul DEPC水 （或ddH2O)溶解。
7、NanoDrop 2000超微量分光光度計定量，讀取OD260/OD280比值。若比值在1.8~2.0之間，可進行下一步逆轉錄反應，若低于1.8，可能存在蛋白污染。
8、若暫時不逆轉錄，RNA置于-80度冰箱保存。