一、實驗目的

1、學習克隆工作中最常用的雙酶切；

2、學習將外源基因與質粒連接方法及操作技術；

3、學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞的技術；

4、了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。

5、外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。

6、學習鑒定重組子的方法。

二、 實驗原理

重組子的建立：采用雙酶切質粒載體pBR322和pUC18，酶切后產生了互補的粘性末端，在T4 DNA 連接酶的作用下，兩個質粒片段連接。

感受態細胞(Competent cells)：受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態細胞(competent cell) 。

轉化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。

電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。

克隆的篩選：主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環素、鏈霉素等；

重組質粒克隆的鑒定：鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有α-互補、小規模制備質粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。最常用的方法是小規模制備質粒DNA進行酶切分析，對于帶有LacZ基因的載體還可以結合α-互補現象來篩選。

三、試劑與器材

1、試劑 pUC18質粒，pBR322質粒，DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切緩沖液, EcoR I(15U/ul)及酶切緩沖液，DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa)，LB液體培養基(Luria-Bertani) ，LB固體培養基，50mg/ml卡那霉素(kanamycin)儲存液，質粒快速提取試劑盒（博大泰克），10 X Buffer K， Pst I，EcoR I (TaKaRa)

2、器材 電基因轉移議，恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養箱，電泳儀，超凈工作臺， 微量移液槍，eppendorf管。

四、操作方法

1．構建重組質粒

質粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切，將酶切產物按照1：1的比例混合，使用T4 DNA連接酶連接，構建成重組質粒。

2．制備感受態大腸桿菌細胞

收集大腸桿菌細胞，采用CaCl2處理，制備成感受態細胞。

3．重組子的轉化

將構建的重組質粒加入到制備的感受態細胞懸浮液中，電擊法將重組質粒轉化到宿主細胞中。

4．重組子的篩選鑒定

采用藍白篩選重組子。酚/氯仿快速抽提質粒，酶切后電泳鑒定。

五、關鍵步驟與注意事項

2．連接反應溫度選擇要適中，過高粘末端之間形成氫鍵不穩定，過低會影響連接酶的活性。

3．連接反應兩種質粒的比例為1：1，否則容易自連。

4．制備感受態細胞時要采用對數生長期初期的細胞，低溫處理時間要足夠。

5．電擊法時電擊電壓、電流、時間選擇要合適。

6．轉化及藍白篩選要作陰、陽性對照，防止出現假陽性、假陰性。