一、 實驗目的

1、了解微生物分離和純化的原理；

2、掌握常用的分離純化微生物的方法；

3、掌握菌落特征的觀察。

4、學習掌握微生物的幾種接種技術

5、 建立無菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環節

二、實驗原理

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術完成。值得指出的是，從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養。

因此，純培養的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特征后才能確定，有些微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。

土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。本實驗將采用不同的培養基從土壤中分離不同類型的微生物。

將微生物的培養物或含有微生物的樣品移植到培養基上的操作技術稱之為接種。接種是微生物實驗及科學研究中的一項最基本的操作技術。無論微生物的分離、培養、純化或鑒定以及有關微生物的形態觀察及生理研究都必須進行接種。接種的關鍵是要嚴格的進行無菌操作，如操作不慎引起污染，則實驗結果就不可*，影響下一步工作的進行。

三、實驗材料

1 培養基和菌種

淀粉瓊脂培養基(高氏I號培養基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，馬丁氏瓊脂培養基，查氏瓊脂培養基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板,營養肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。

2 溶液或試劑

10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。

3 儀器 或其它用具

無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環，無菌培養皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細胞計數板、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

四、實驗步驟

1、流程

倒平板→制備梯度稀釋液→涂布（或劃線法）→培養→挑單菌落→保存。

2、步驟

2.1稀釋涂布平板法

2.1.1 倒平板

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、高氏I號瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基加熱溶化待冷至55～60℃時，高氏I號瓊脂培養基中加入10%酚數滴，馬丁氏培養中加入鏈霉素溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。

2.1.2 制備活性污泥混合液稀釋液

稱取土樣l0g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。

用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換一支試管。

2.1.3 涂布

將上述每種培養基的三個平板底面分別用記號筆寫上10 -4 、10 -5 和10 -6 三種稀度，然后用無菌吸管分別由10 -4 、10 -5 和10 -6 ，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對應平板培養基表面中央位置。

用無菌玻璃涂棒，右手拿無菌涂棒平放在平板培養基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養基。

2.1.4 培養

將高氏I號培養基平板和馬丁氏培養基平板倒置于28℃溫室中培養3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養2～3d。

2.1.5 觀察并挑菌落

將培養后長出的單個菌落根據其大小、顏色、形狀等特征進行觀察，之后根據菌落不同特征分別挑取少許細胞接種到上述三種培養基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養。若發現有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。