核蛋白的免疫熒光定位實驗
2021-07-21 10:46 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
實驗方法原理:免疫熒光細胞化學技術是采用熒光素標記的已知抗體(或抗原)作為探針,檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原(或抗體),形成的抗原抗體復合物帶有熒光素,在熒光顯微鏡下,由于受高壓汞燈光源的紫外光照射,熒光素發出明亮的熒光,這樣就可以分辨出抗原(或抗體)的所在位置及其性質,并可利用熒光定量技術計算抗原的含量,以達到對抗原物質定位、定性和定量測定的目的。
實驗材料:核蛋白
試劑、試劑盒:甲醇 PB 一抗 二抗
儀器、耗材:顯微鏡 玻片 蓋玻片 滴管
實驗步驟:
1.在22x22 mm 的1.5號蓋玻片上培養細胞。理想條件下細胞應長到50%~70%匯合。
2. 在-20℃用100%甲醇固定細胞3分鐘。
3.用PBS + 1% NGS洗三次,每次10分鐘。
4.在濕盒里以適當濃度的一抗室溫溫育1小時。
5.用PBS + 1% NGS洗三次,每次10分鐘。
6.在濕盒里與稀釋為4 ug/ml 的熒光標記二抗室溫溫育1小時。
7.用PBS洗四次,每次10分鐘。
8.用封片劑將蓋玻片封在載波片上,用干凈的指甲油將蓋玻片封邊,防止蓋玻片滑動。
注意事項:
1.要在蓋玻片一邊角落做記號,以知道細胞在蓋玻片的那一面。
2.一抗的濃度需要經過實驗摸索確定。
3.第四步中如果用22×22 mm 蓋玻片,則在蓋玻片上加30 ul 稀釋的抗體,并且將蓋玻片倒置在玻璃載玻片上,然后將載玻片放到濕盒里,在室溫溫育。
其他:
核蛋白是指在細胞質內合成, 然后運輸到核內起作用的一類蛋白質。如各種組蛋白、DNA合成酶類、RNA轉錄和加工的酶類、各種起調控作用的蛋白因子等。核蛋白一般都含有特殊的氨基酸信號序列, 起蛋白質定向、定位作用。