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瓊脂糖凝膠電泳實驗原理

2021-07-21 13:25 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
實驗原理
瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定 DNA、RNA 分子混合物,以瓊脂凝膠作為支持物,利用 DNA 分子在電場中時的電荷效應和分子篩效應,達到分離混合物的目的。DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負電,在電場中由陰極向陽極運動。在一定的電場強度下,忽略DNA分子攜帶的電荷,DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與相對分子量成反比。


材料、試劑及器具
1、材料
合適的Marker(分子量標準);DNA 樣品
2、試劑
加樣緩沖液(6x或10x);瓊脂糖;溴化乙錠(EB)。
3、器具
(1)電泳系統:電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
(2)凝膠成像系統或紫外透射儀。


實驗過程
1、按所分離的 DNA 分子的大小范圍,選擇合適的比例的凝膠,稱取適量的瓊脂粉,放到一錐形瓶中,加入適量的 TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至瓊脂粉完全溶化,溶液透明。稍搖勻,得膠液。待膠液卻至 60℃左右,在膠液內加入適量的比例的溴化乙錠液。
2、水平放置膠槽,在一端插好梳子,在槽內緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液,使之形成均勻水平的膠面。
3、待膠凝固后,小心拔起梳子,使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
4、在槽內加入TBE電泳緩沖液,至液面覆蓋過膠面。
5、把待檢樣品,按合適比例與加樣緩沖液混勻,用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
6、接通電泳儀和電泳槽,并接通電源,調節合適電壓,穩壓輸出,開始電泳。
7、觀察溴酚蘭的帶(藍色)的位置。當其移動至約凝膠長2/3處時,可停止電泳。
8、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜,趕去氣泡平鋪,然后把凝膠放在上面。關上樣品室外門,打開紫外燈(360nm 或 254nm),通過觀察孔進行觀察。


注意事項
1、電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性、強致癌性物質,務必小心,勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門電泳區域操作,戴一次性手套,并及時更換。
2、預先加入EB 時可能使 DNA 的運動速度下降15%左右,且不同構型的 DNA 的影響程度不同。所以為取得較真實的電泳結果可以在電泳結束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,若凝膠放置一段時間后才觀察,即使原來膠內或樣品已加 EB,建議選擇EB溶液浸泡染色。
3、加樣進膠時不要形成氣泡,需在凝膠液未凝固之前及時清除,否則,需重新制膠。
4、電泳時溴酚蘭在瓊脂糖凝膠中的運動速度可以用于參考電泳速度,已實際電泳條帶運動速度為準。
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