一、酶免疫組化的關鍵環節

1、標本固定：固定的目的是①防止標本從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果；③固定的標本易于保存。

2、脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。

3、脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。脫蠟可以先60度20min,然后立即二甲苯1-3分別10min,但當天制好的切片可以60度3-4h.水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。

4、抗原修復：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。我們實驗室一般用微波修復中火6min*4次，效果不錯。注意微波修復后自然冷卻30min左右（只要你覺得修復液的溫度達室溫即可）。

5、細胞通透：目的是使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。在免疫組織化學（>10um厚切片）和免疫細胞化學中一般用TritonX-100作為細胞通透劑，在膜上打孔。

6、滅活內源性過氧化物酶和生物素：在傳統的ABC法和SP法中，免疫組化反應結果容易收到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活。滅活內源性POD一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右，而0.3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般10~30min；用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片；現用現配，配好后4度避光保存。不過，現在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內源性生物素的干擾，推薦使用。

7、血清封閉：組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續結果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫或37度10-30min.

8、一抗和二抗濃度和孵育時間：一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h,而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min.具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h,具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。

9、抗體稀釋液：其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。正因為這種原因，我一直用國產的專用抗體稀釋液，一段時間在更換新抗體稀釋液時實驗結果出現了陰性結果（提示可能一抗沒有結合），最后從抗體濃度和孵育時間、封閉時間等原因排除后，發現是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應不佳，終而出現假陰性結果。

10、切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.

注意：（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M.（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）。

11、DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗；DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。

12、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經常用蘇木素復染（胞核染料）。注意蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數秒-數分鐘，胞漿蛋白可以適當時間長一點，而胞核蛋白則要短。不過這個如果染色不理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。

鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。

13、封片：為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。

二、免疫熒光方法中的重要環節

1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。

2、組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min,尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。

3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min.

4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h,而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min.具體條件還要摸索。免疫組化實驗www.secondantibody.com

5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h,具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。最后，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當的離心。

6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。

7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。

8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.注意（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M.（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）。

9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min,超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。